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遗传学名词，DNA(Deoxyribonucleic acid)，中文译名为脱氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分，同时也是基因组成的，有时被称为“遗传微粒”。cDNA指与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由依赖RNA的DNA聚合酶（反转录酶）的作用而合成，并且在合成单链cDNA后，在用碱处理除去与其对应的RNA以后，以单链cDNA为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA。cDNA是互补脱氧核糖核酸，为具有与某mRNA(信使RNA)链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementary DNA之缩写，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。
cdna_cDNA -内容简介
cDNA真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA，在遗传工程方面广为应用。
cdna_cDNA -阶段构建
cDNA分为六个阶段：
阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链
阶段2：cDNA第二链的合成
阶段3：cDNA的甲基化
阶段4：接头或衔接子的连接
阶段5：SepharoseCL-4B凝胶过滤法分离cDNA
阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接
详解
一、构建cDNA文库：以生物细胞的总mRNA为模板，用反转录酶合成互补的双链cDNA，然后接到载体上，转入到宿主后建立的基因文库就是cDNA文库。
1、mRNA的提取及其完整性的确定
1）总RNA的提取
RNA提取方法：APGC法或NP-40或应用试剂盒提取总RNA
2）mRNA的分离
高等真核生物mRNA分子的3'端均有poly(A)尾，将总RNA通过寡聚（DT）纤维柱分离mRNA或利用磁珠法制备纯mRNA。在某些情况下，裂解细胞后用蔗糖梯度来制备mRNA-核糖体复合物作为提取mRNA的替换途径。
3）mRNA的纯化①按照大小对总mRNA进行分级，主要用琼脂糖凝胶电泳和蔗糖密度梯度离心法进行分级；②多聚核糖体的免疫学纯化法，这是利用抗体来纯化合成目的多肽的方法。
4）mRNA完整性的确定
确定mRNA完整性的方法有三种：
①直接检测mRNA分子的大小；
②测mRNA的转译能力；
③检测总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力。
2、cDNA的合成和克隆
1）cDNA第一链的合成
用亲和层析法得到mRNA后，根据mRNA分子的3'端有poly(A)尾结构的原理，用12~20个核苷酸长的oligo（dT）与纯化的mRNA混合，oligo（dT）会与poly(A)结合作为反转录酶的引物，反转录反应的产物是一条RNA-DNA的杂交链。oligo（dT）结合在mRNA的3'端，因此合成全长的cDNA需要反转录酶从mRNA分子的一端移动到另一端，有时这种全合成难以达到，尤其是mRNA链很长时，为此建立了一种随机引物法合成cDNA。随机引物是一种长度为6~10个核苷酸，由4种碱基随机组成的DNA片段。与oligo（dT）仅与mRNA3'端结合不同，它们可以在mRNA的不同位点结合。随机引物法合成的产物也是RNA-DNA的杂交体。把cDNA克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的RNA转变成DNA链，即形成双链DNA分子。
2）.双链cDNA的合成
合成cDNA第二条链有两种方法。一种方法是利用cDNA第一链的3'末端常常出现发夹环的特征，这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“返折”并且进行复制第一链的结果，它为合成cDNA第二链提供了有用的引物。用这种方法合成的双链cDNA在一端有一个发夹环，可以用单链特异的S1核酸酶切去。但是S1核酸酶的处理，常常会“修剪”过多的cDNA顺序，使cDNA丢失了mRNA5'端的部分顺序。另一种方法是用大肠杆菌的RNaseH进行修饰。RNaseH能识别RNA-DNA杂交分子并把其中的RNA切割成短的片段，这些RNA短片段仍与cDNA第一链结合，可被新合成的DNA所取代。新合成的DNA存在切口，用DNA连接酶把这些切口连接在一起形成一条完整的DNA链。RNaseH法优于S1核酸酶法，它能获得包括mRNA5'端全部或绝大部分的更长顺序cDNA分子。
3）将cDNA重组到载体上合成的cDNA与载体DNA进行连接一般有3种方法：
①借助于末端转移酶的3'-OH端合成均聚物的能力，双链cDNA和线性化载体DNA的3'-OH端分别加上均聚核苷酸链；
②双链cDNA和线性化载体DNA分别用Klenow片段进行末端补平，然后用T4DNA连接酶进行齐头连接，形成重组体；
③通过粘性末端连接。
4）.转化
重组的载体DNA分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。当不同重组的DNA含有不同的cDNA基因时，整个转化子含有来自mRNA群体的各种cDNA基因，这样的转化子群体构成该mRNA全部遗传信息的cDNA基因文库。
5）.目的cDNA克隆的鉴定
用于从cDNA文库中筛选和鉴定目的cDNA的方法主要有3种：
①核酸杂交②免疫学杂交检测③cDNA同胞选择
cdna_cDNA -作用
cdna sequencing resultsComplementaryDNA常用于基因克隆和基因诊断。
在这种情况下，mRNA的cDNA，与原来基因的DNA（基因组DNA，genomic DNA）不同而无内含子；相反地对应于在原来基因中没有的而在mRNA存在的3′末端的多A序列等的核苷序列上，与exson序列、先导序列以及后续序列等一起反映出mRNA结构。cDNA同样可以被克隆。
cdna_cDNA -相关内容
cDNA. 仪器库：40000 抗体库：300,000 试剂库 210,000 供求库：45000 cDNA库：18000
siRNA：20000. cDNA总库 ・ 人cDNA | 小鼠cDNA | 小牛cDNA | 兔cDNA | 鸡cDNA | 大
鼠cDNA | 植物cDNA | 其它cDNA ・ 特异性cDNA库-细胞凋亡类
cdna_cDNA -cDNA探针
cDNA因与mRNA互补，所以用cDNA制成的探针有如下优点：不存在内含子，不存在高度重复序列，适用于基因表达的研究。
cdna_cDNA -筛选鉴定
1、核酸杂交
是最常用,最可靠的方法之一.可大规模地分析文库的克隆子.
1)同源探针:至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列.常用于以一个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆.
2)部分同源探针:探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同.常用于克隆家族基因.
3)总cDNA探针:通过反转录酶均匀掺入放射性核苷酸或通过总的或分级分离得到的poly(A)+mRNA进行末端标记而获得cDNA探针.
4）cDNA扣除探针:从第一种mRNA制备cDNA探针,连续多次与20倍过量的第二种mRNA杂交;回收未杂交的cDNA探针,再与100倍过量的第一种mRNA杂交,使得原mRNA中的一些 特异序列得到高度富集.
主要用于探测cDNA文库中与调节水平有所差别的mRNA克隆.
5)合成寡核苷酸探针
2、特异性免疫学检测
在cDNA表达文库中,目的基因的表达产物能与特异性抗体发生免疫学反应,通过酶学的方法加以检测
3,cDNA克隆的同胞检测
将cDNA文库分成若干组含有10-100个克隆子的易于处理的亚cDNA文库,对每组亚cDNA文库进行检测,当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测,直到获得阳性单克隆.
4,cDNA克隆的确证
cDNA克隆含有编码某一特定蛋白质的完整氨基酸序列的开放读框.
第四节目的基因的分离
外源基因:
插入到载体内的那个特定的片段基因.
目的基因:
那些已被或者准备要分离,改造,扩增或表达的特定基因或DNA片段。
