爱华网微生物限度检查是对生产单位所用的药品原料、器具设备、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生评价的综合依据。由于微生物限度检查程序繁琐，操作严格，检查周期长，干扰因素多等原因都会造成检验结果误差，这样难以对生产做出系统、科学的管理。现就微生物检查时，容易引起误差的几个方面原因以及控制方法分析如下。
风险一：检验方法
微生物限度/生物负载检验是对待测样品中的微生物含量进行精确测定的实验。其实验方法分为培养基法和薄膜过滤法两大类。
薄膜过滤技术是20世纪60年代以来发展起来的一项分离技术，它具有操作条件温和、无污染、无相变等特点，在许多方面都得到应用，如用于微生物检测。薄膜过滤是通过使用一定孔径的滤膜从液体中截留微生物，然后将其放在培养基上，使该微生物在膜表面成长为菌落，最后对其进行培养、计数、鉴定等。薄膜过滤方法不仅可用于饮料的微生物检测，也可用于冲洗水、加工水、污水中的微生物检测，是一种国际公认的微生物检验方法，得到了AOAC、美国、欧洲和日本等国家的药典、FDA和EPA等组织的承认，广泛应用于制药工业、食品及饮料工业、环境监测、化妆品品质控制和电子工业等领域。
与培养基法相比，薄膜过滤方法具有以下两大优点：
1.提供更准确的检测结果：薄膜过滤法可以从大量的液体中富集少量的微生物，与传统的检测方法相比能够提供更为精确的检测结果，也可减少在检测过程中取样不均而导致的假阳性，检测的灵敏度可达1CFU。
2. 可以通过冲洗去除抑制性物质（如防腐剂），从而降低抑制剂对检测结果的影响。
采用薄膜过滤法,滤膜孔径应不大于0.45um,直径一般为50mm,若采用其他直径的滤膜,冲洗量应进行相应的调整。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品,其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量为100ml。总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。
风险二：取样计划
《GMP实施指南》中明确指出样品应具有代表性，应能反映整批产品的情况和工艺情况。只有在对取样方法和分析方法开展相关的验证工作后，才能够根据样品的参数做放行决定或者进行工艺调整。
在允许范围内，取样体积要尽可能大，因为大体积的样品更能够反映产品整体状况。例如图1对某药厂的制药用水进行监测，纵坐标表示在取样量为1L（浅蓝色）和100ml（深蓝色）时被检测到的铜绿假单胞菌的数量，可以明显观察到取样量为1L的样品中的微生物计数要高于100ml，但是这个不是严格成比例的。增加取样量能够改善在低数量微生物计数时的不确定性，由此获得更高的精确度和统计学意义上的计数。另外当取样100ml时发现没有微生物存在的情况下，取样1L可明显发现微生物的存在。因此对于低污染水平，100ml的取样样本非常明显地增加了风险：在和实际污染存在的情况下误以为系统是干净的。但是当我们将取样体积提高到1L时这样的风险就被降低了：因为增加取样体积改善了对整个水系统监控的力度。
图1：
另外参照美国药典《1227》结果精密度分析，微生物技术结果的精密度与菌落的多少有直接关系，菌落数偏小的情况下会造成计数结果的误差率过大，因此大的取样体积相应会增加结果的准确性。
风险三：恢复生长率
薄膜过滤时，主要考虑两个影响因素：
1、截留
样品过滤时，微生物被截留在滤膜上，此时要关注捕获微生物的能力。
2、恢复生长
培养基透过滤膜为微生物提供营养成分，使其繁殖生长成肉眼可见的菌落，此时要关注以下几个因素：
1、被捕获微生物的生长能力；
2、微生物必须能够繁殖；
3、确保过滤基质能够使营养物质通过；
4、要给微生物提供合适的营养成分，培养温度和时间；
从图2中可以看出：大孔径的滤膜（0.8μm和1.2μm）允许一些小的微生物在较低挑战级别下透过，但是对于0.45μm或者0.22μm孔径的滤膜则不会有透过。
虽然0.22μm滤膜能够截留挑战微生物，但是在所有的测试体系中恢复生长率均小于0.45μm的滤膜。
对于大孔径的滤膜（>0.7μm）透过率可能是造成恢复生长率低于其它小孔径滤膜的原因。
大于0.45μm的滤膜能够提高流速、透过性，偶尔也能够增大菌落尺寸（方便计数）。然而，这些大尺寸滤膜也可能对某些微生物造成截留率的不足。因此，他们不适合菌落总数计数。但大孔径的滤膜可以用于特定微生物的计数，如粪大肠菌群或者酵母菌。它们也可以用于难以过滤的样品以提高透过性或者需要过滤大体积的样品。这两种情况下，都应该对目标微生物的截留特性进行证明。
孔径小于0.45μm的滤膜的缺点是降低了流速、透过性，当然也会降低恢复生长率。因此，通过我们的研究，0.2μm的滤膜并不适合用于对总需氧菌、酵母菌和霉菌的计数。
图2：不同孔径滤膜的恢复生长率
总的来说，微生物恢复生长率要关注的影响因素有：
1、微生物种类和状态
2、孔径
3、抑制性物质
4、使用滤膜的结构和化学成分
5、生长用培养基
6、培养时间和温度
风险四：膜片的选择
在膜过滤的检测中，为了保证更好的检测结果，应根据检测的情况选择合适的滤膜。主要考虑的因素有孔径、颜色、材质、无菌性等。
孔径：关系到微生物的截留效率、流速和恢复生长率，用于微生物检测时，需要根据检测的微生物指标来选择合适孔径的滤膜，如：
0.22μm：致病菌和某些验证用菌种的捕获
0.45μm：普通细菌的截留和培养
0.7μm：粪大肠菌群的截留和培养
0.8μm：酵母菌和霉菌的截留和培养
1.2μm：难过滤样品中霉菌和酵母菌的截留和培养
通常建议使用 0.45µm滤膜，因为 0.45µm能够提供较好的截留率，更好的流速和广谱微生物稳定的恢复生长率。
颜色：为了增加计数时的本底对比度，根据菌落颜色的不同，需要选择不同颜色的滤膜，当菌落的颜色为白色、透明或苍白色时，可选择绿色或黑色的滤膜；当菌落在生长的过程中会有色素产生时，可选择白色的滤膜。
材质：从化学兼容性和抑菌性残留的角度进行考虑，微生物实验膜片的材质主要有两种：MCE(混合纤维素)和PVDF(聚偏二氟乙烯)。由于化学兼容性的不同：中性的样品（如水等）选用MCE膜片即可；而对于强酸（如1N盐酸）或强碱（如3N氢氧化钠）则应使用PVDF膜片。另外，PVDF材质膜片的吸附性更低，因此更适于含抑菌性物质的样品（如抗生素）的检测。
无菌性，目前主要分无菌滤膜和可灭菌滤膜两种，一般按照我们使用的滤器进行选择，为了保证灭菌过程不会破坏滤膜的完整性，应该选用出厂前即完成灭菌的滤膜。中国药典除了对微生物实验中使用的滤膜孔径进行规定之外，还提到“滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。”，但是实际在自行高温高压灭菌的同时，对滤膜本身是有一定的损害的，用户无法自行完成完整性的测试工作，因此建议使用厂家COA进行质量保证的无菌滤膜。
网格：为了便于计数，选用带网格的点状膜，既不影响观察菌落形态，又便于观察计数。滤膜上的网格由细小的点组成，使用特殊的油墨（对微生物无毒性）印刷到滤膜表面，这样截留在附近的微生物就能够跨越网格进行生长而不受网格的影响。
风险五：过滤硬件设备的选择
在微生物检测实验中，实验结果容易受到设备、环境和人员操作的影响产生假阳性。为了避免假阳性的风险，对于环境、人员以及设备都有严格的要求。
环境：微生物限度检查的全过程，均应遵守无菌操作，严防再污染，因此要求在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B级单向流空气区域内进行，限度检查实验室应配有相应的人流和物流缓冲间，并定期作环境监测。
人员：所有人员在上岗前要接受必须的GMP培训、无菌操作技术、设备操作、更衣培训、微生物检验技术和试验室生物安全等方面的培训，经考核合格后方可上岗。检验人员必须熟悉相关监测方法、程序、检验目的和结果评价。
设备：选择的硬件设备一定要具备以下特性：
1、操作简单，设备易于维护，过滤速度快
2、能保证足够的真空度，符合ISO8199的要求；
3、应便于滤膜的取置；
4、抽滤管路易于清洁，不会反向污染滤膜；
5、适用于层流台或者安全柜（真空泵应放在层流区域外，或者使用内置隔膜泵）；
6、接触滤膜的支座易于清洁和灭菌，避免有死角；
7、经过恰当的验证；
8、滤杯应易于清洁和灭菌，易于读取体积，便于叠放
