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0引言由于保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）与嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus）之间存在互惠共生作用，使其在乳品工业中得到了广泛的运用[1]。通常利用这两种乳酸菌混合发酵会提高产酸速度，减弱后酸化程度，促进风味物质产生[2]，产生更多的胞外多糖，所以传统上常采用二者混合发酵制作酸奶。伴随分子生物技术的不断发展，人们开始从微观的角度去研究保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的共生机制。2001年，完成了第一株乳酸菌（Lactococcuslactisssp. lactisIL1403）的全基因序列测序工作[3]。迄今为止，已经公布了至少7株保加利亚乳杆菌和14株嗜热链球菌的全序列基因组，其中包括本实验室于2010年完成测序的保加利亚乳杆菌ND02与嗜热链球菌ND03。这为我们从分子水平上去全面了解乳酸菌的共生机制奠定了基础。1 共生过程中菌株的生长变化通常情况下，保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的相互作用表现为互惠共生。它们在乳中发酵时，从开始接菌到发酵结束其过程一般可分为3个阶段，即发酵前期、发酵中期、发酵后期。发酵前期：嗜热链球菌进入对数生长期，而保加利亚乳杆菌的生长受到抑制，此时，嗜热链球菌是主要的产酸菌株[1]。发酵中期：嗜热链球菌的生长进入了稳定期，而伴随着pH值的下降保加利亚乳杆菌生长开始进入对数生长期。发酵后期：保加利亚乳杆菌的生长进入稳定期，嗜热链球菌开始“二次生长”[4]。这一现象与我们所做的保加利亚乳杆菌ND02与嗜热链球菌ND03的共生试验结果相一致。在2.5h到3.5 h发酵过程中，ND03活菌数维持在8.6 mL-1(对数值)，当保加利亚乳杆菌ND02进入稳定期后， 嗜热链球菌出现了二次生长现象使得其活菌数达到9.5mL-1（对数值）。一些科学家认为引起该现象的原因是由于细胞壁蛋白水解酶PrtB在促进嗜热链球菌的“二次生长”中起了重要作用[5]。值得注意的是，由于菌体的个体差异，在实验过程中我们偶尔也会发现两种菌在生长过程中表现为中性甚至抑制相互生长的现象。因此，并非所有的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌都能互惠共生。近几年，许多试验证明即使表现为共生的菌株，在某些机制上也同样存在着竞争现象。从多方面考虑，保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的混合发酵更有利于嗜热链球菌菌株的生长。第一，保加利亚乳杆菌比嗜热链球菌有更高的营养需求，尤其是对氨基酸和甲酸的需求，这使得初期阶段嗜热链球菌较保加利亚乳杆菌生长快，使嗜热链球菌在争夺乳中有限营养物质上占据了优势[4]。第二，混合发酵温度一般为42℃，与保加利亚乳杆菌的最适生长温度（45~50℃）相比更接近嗜热链球菌的最适生长温度（40~45℃），从而更加有利于嗜热链球菌的生长。2 共生过程中菌株的主要生理变化目前，众多研究者采用基因组学和蛋白质组学相结合的方法研究保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在乳中混合发酵过程中的生理变化。他们的研究发现，与单菌培养相比较，主要有以下几个方面的变化：肽类、氨基酸转运蛋白以及某些氨基酸生物合成途径的变化，与核苷酸碱基代谢，氧化性应激以及糖代谢相关的基因以及蛋白质类物质的变化。2.1 蛋白质代谢由于牛乳中游离氨基酸的含量较低，从而限制了乳酸菌的生长，因此嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌必须将酪蛋白降解为肽类和氨基酸，以满足其对含氮类物质的需求。传统上，我们认为虽不同的保加利亚乳杆菌水解蛋白能力具有一定的差异，但总体上其水解能力要高于嗜热链球菌。保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌蛋白水解能力的差异主要是由它们含有的不同酶类造成的。研究发现，保加利亚乳杆菌中含有一种可以降解酪蛋白的细胞壁蛋白水解酶PrtB，而只有很少一部分嗜热链球菌含有和PrtB具有同源性的胞外蛋白水解酶PrtS[5]。更为值得注意的是，在PrtB存在的情况下，PrtS对嗜热链球菌生长的促进作用表现的并不明显。1990年，Rajagopal等通过测定酪氨酸的释放情况，对保加利亚乳杆菌的蛋白水解能力进行了较为全面的评估[9]。研究表明，保加利亚乳杆菌可以产生除天门冬酰胺、谷氨酸、半胱氨酸外的所有氨基酸。其中，脯氨酸、赖氨酸、缬氨酸占总氨基酸产量的42%~43%。大多数嗜热链球菌的生长都需要蛋氨酸、组氨酸、脯氨酸以及谷氨酸[7]，而前3种物质则主要是由保加利亚乳杆菌提供的。由于多数保加利亚乳杆菌无法合成谷氨酸，而酪蛋白和许多的肽类物质都含有丰富的谷氨酸，因此谷氨酸很可能是以肽类的形式提供的。以前，人们认为保加利亚乳杆菌可以为嗜热链球菌提供生长需要的全部氨基酸和肽类物质。然而，有研究发现在两种菌株混合培养时，嗜热链球菌的含硫氨基酸合成途径仍然是开通的，但是其浓度与其它氨基酸相比较反而降低。这说明嗜热链球菌生长所需的某些氨基酸或肽类物质有可能是保加利亚乳杆菌所不能供给的，从而暗示了在混合培养时，菌株的氮类物质（特别是含硫氨基酸）代谢很可能存在更为复杂的相互作用机制[8]。近几年，科学家发现当保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌LMG18311混合发酵时，后者的氨基酸代谢发生明显变化[14]。首先体现在缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸这三种支链氨基酸（BCAA）的合成中。支链氨基酸不仅对促进嗜热链球菌的生长具有重要作用，而且还是乳酸菌蛋白质组成的重要物质，约占总蛋白质氨基酸含量的20%[9]。更为重要的是支链氨基酸的合成途径广泛存在于嗜热链球菌中，而在保加利亚乳杆菌中却不存在[7]。缬氨酸和异亮氨酸需要以丙酮酸盐为前体，在lvBN，IlvC，IlvD1和AT四种酶的催化作用下生成，而亮氨酸的形成还需要LeuA，LeuD和LeuB这三种酶的参与。在保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的生长高峰期，ilvC和ilvD1基因的转录以及IlvC、IlvB、LeuB的含量均有所提高。与此同时，异亮氨酸和缬氨酸的tRNA合成酶IleS和ValS的含量也增加。这说明保加利亚乳杆菌促进了嗜热链球菌中支链氨基酸的合成，从而满足彼此对氨基酸的需求并促进各菌株的生长繁殖，从而实现两种菌的互惠共生[14]。其次，嗜热链球菌中精氨酸的合成量增加。精氨酸的合成需要以谷氨酸盐作为底物经过ArgJ，ArgB，ArgC和ArgD四种酶的作用生成鸟氨酸，鸟氨酸在经过ArgF，ArgG和ArgH三种酶的作用后形成。值得注意的是，ArgH在分解精氨酸琥珀酸酯的同时产生延胡索酸和精氨酸。在共生条件下，嗜热链球菌的argCJBD和argH基因的转录增加。RTqPCR结果显示，argH基因过表达了约57倍。同时，延胡索酸的含量也不断增加，从最初的45μmol/L可以达到最后的131μmol/L[10]。除此之外，研究还发现在共生条件下，嗜热链球菌中与苏氨酸的生物合成途径相关的thrB基因也产生超表达现象，说明很可能改变了参与酸乳中重要风味物质乙醛生成的苏氨酸的合成。实际上，许多氨基酸和短肽都是酸乳中的风味物质或是风味物质的前体。混合发酵提高了氨基酸以及短肽的产量，使更多的风味物质得以生成，改善了酸奶的产品风味。我们在实验中就曾发现，一些单菌发酵会产生苦味物质的菌株与某些菌株混合发酵后可以减弱甚至消除这种苦味。所以，保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的共生不仅促进了菌株的生长繁殖，还改善了酸乳的品质。2.2 核苷酸碱基代谢对于所有的生物而言，核苷酸类物质是极为必要的。它们不仅是RNA和DNA生物合成的底物，而且还是细胞代谢的能量载体[9]。在乳中，嘌呤核苷酸类物质是限制嗜热链球菌生长的主要因素。嗜热链球菌中嘌呤核苷酸类物质的合成从PRPP在乳中，嘌呤核苷酸类物质是限制嗜热链球菌生长的主要因素。嗜热链球菌中嘌呤核苷酸类物质的合成从PRPP(5-phosphoribosyl-α-1-pyrophosphate）到IMP要利用9种酶，然后分别通过两组不同的酶purA，purB和guaB，guaA形成AMP和GMP。嗜热链球菌的基因组中包含了与嘌呤生物合成相关的所有酶的基因[11]。有研究表明，在乳中加入嘌呤类物质后将更有利于嗜热链球菌的生长。但是将嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌进行混合培养后发现，尽管嗜热链球菌的生长得到了促进，但是嗜热链球菌中嘌呤的生物合成却出现了减弱现象[12]。这表明在混合培养过程中，保加利亚乳杆菌可能给嗜热链球菌提供了嘌呤类物质或者嘌呤类物质前体。以下几点可以支持这一理论：第一，保加利亚乳杆菌拥有完整的嘌呤合成途径，且培养基中含有丰富的嘌呤类物质。第二，嗜热链球菌中编码嘌呤和嘌呤底物转运蛋白的基因出现超表达的现象，如编码黄嘌呤/尿嘧啶通透酶的基因（stu0336）。此外，编码磷酸核糖转移酶的四个基因Hpt，Apt，Xpt和HprT也出现超表达现象，同时它们还参与核苷酸碱基的磷酸化。第三，在嗜热链球菌的培养基中添加嘌呤类物质，可以导致与其嘌呤核苷酸类物质合成相关的PurM，PurH，Fhs等酶类的表达出现下调现象，说明外源嘌呤类物质可以抑制嗜热链球菌本身拥有的与嘌呤类物质相关的生物合成途径[13]。第四，与嗜热链球菌嘌呤核苷酸合成相关的PurR基因出现超表达现象。此外，控制PRPP合酶生成的prsA1基因出现下调现象。嗜热链球菌中的PurR是一种并发性的阻抑蛋白，其阻抑机制与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）[14]类似。当向媒介中添加嘌呤类物质时，PrsA1（PRPP合酶）的活性受到抑制，导致细胞内的PRPP的浓度降低，此时，PurR阻抑蛋白被激活并对嘌呤的合成进行抑制。综上所述，prsA1基因表达的下降说明嗜热链球菌在嘌呤核苷酸类物质合成的中间环节受到抑制，而PurR基因的过表达现象可能与保加利亚乳杆菌的嘌呤类物质的大量合成有关，从而更有利于菌株的共同生长。2.3 氧化性应激虽然氧气对大多数乳酸菌的生长起着非常重要的作用，但在有氧呼吸作用过程中会产生一些活性氧（ROS），如过氧化氢、羟自由基以及超氧自由基等。这些物质会触发脂质、蛋白质以及核酸等大分子物质的氧化，从而对乳酸菌产生致命的损害[15]。最近，人们通过实验发现某些保加利亚乳杆菌在生长过程中会产生少量的过氧化物。在对S.thermophilus LMG18311和产过氧化物的保加利亚乳杆菌进行共生机制研究时发现，嗜热链球菌中所有发生表达变化的基因中与铁代谢相关的约20%。这说明在共生过程中嗜热链球菌发生氧化性应激反应[10]。此外，过氧化物的存在会破坏Fe-S物质的结构[16]。2008年，有人指出混合发酵与嗜热链球菌单菌发酵相比较，与嗜热链球菌Fe-S物质合成有关的stu0164和sufD基因发生高水平表达现象，从而说明在菌株共同生长过程中有过氧化物产生。进一步研究发现，在生长高峰期，与保加利亚乳杆菌二价铁转运蛋白合成相关的feoA基因的表达水平降低，而一种可以提高嗜热链球菌对过氧化氢耐受性的胞内铁蛋白的dpr基因得到了高度的表达。在共同发酵的最后阶段，伴随着保加利亚乳杆菌所产生过氧化物浓度的降低，嗜热链球菌通过诱导多种机制降低细胞内的铁浓度。与此同时，与DNA转葡糖基酶编码相关的mutS，mutY和ung基因也发生高表达，而DNA转葡糖基酶在修复由于氧化性应激对DNA造成的损害方面具有重要作用[17]。这种代谢现象有利于通过芬顿反应限制共生环境中活性氧类物质的含量，从而保证了保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的协调共生。2.4 糖代谢嗜热链球菌依靠非磷酸转移酶系统中的乳糖通透酶（LacS）将乳糖运输到细胞内，乳糖在β-半乳糖苷酶（LacZ）的作用下将乳糖作为碳源并转化为葡萄糖和半乳糖[18]。值得注意的是，多数的嗜热链球菌只能利用分解后的葡萄糖产生乳酸而只有少数的Gal+菌株能通过Leloir途径分解半乳糖。而保加利亚乳杆菌通过磷酸转移酶系统进行乳糖的运输，对于半乳糖几乎不利用（只有极少数菌株在乳糖含量有限的环境中会利用半乳糖）。但我们在实验中发现，某些保加利亚乳杆菌或嗜热链球菌在蔗糖中要明显好于在葡萄糖中的生长状况，这说明乳酸菌对双糖的利用可能存在更复杂的机制。保加利亚乳杆菌由于缺少丙酮酸甲酸裂解酶从而缺少生长需要的嘌呤和甲酸[19]。早在20世纪60年代末，Galesloot等人就发现经过热处理的乳中含有甲酸钠，在促进保加利亚乳杆菌的生长方面具有重要作用[20]。但是在实际生产中多采用较温和的处理方法，所以甲酸钠形成不多，促进效果并不明显。而嗜热链球菌可在无氧或低氧条件下利用糖酵解产生的丙酮酸生成甲酸，同时利用尿酶的催化作用将尿素降解生成二氧化物促进保加利亚乳杆菌的生长，从而实现两种菌株的互惠共生。最近，人们在对S.thermophilus LMG18311与保加利亚乳杆菌的共生机制研究时，发现在混合培养过程中嗜热链球菌中与Leloir途径相关的两种蛋白GalE1，GalK，以及GlmS 和戊糖磷酸途径相关的rpe基因均出现过表达现象，这些变化影响乳酸菌的生长速度[8]。GlmS可以利用6-磷酸果糖参与核苷酸糖以及核苷酸氨基糖的合成。GalE1、GalK通过Leloir途径生成葡萄糖-1-磷酸，这种物质既是Leloir途径与葡萄糖代谢途径相连接的重要物质，也是胞外多糖和鼠李糖等多糖类物质合成所需的核苷酸糖的前体。这两种物质的高表达有利于提高乳酸菌对半乳糖的利用，从而可以缓解菌株对乳中有限碳源的竞争。目前，人们对于胞外多糖类物质的研究还主要集中在如何提高胞外多糖的产量等实用性方面。尽管有人指出胞外多糖不仅在避免细胞受到机械损伤以及提高抗菌性方面具有重要作用，同时还可以将胞外多糖作为碳源利用。但对胞外多糖以及鼠李糖等多糖的功能仍然缺乏全面的了解。可以确定的是，在保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的共生过程中多糖类物质确实发生了变化，如胞外多糖产量的增加。我们在实验中也发现混合发酵后酸乳的粘度明显提高。但更为奇妙的是，Bouzar还发现保加利亚乳杆菌单独发酵的发酵乳中的胞外多糖和保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌共同发酵的发酵乳中的胞外多糖的组成成分不同[21]，这其中的机制需要进一步的研究。3 结束语自1980年以来，虽然科研者们对保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的共生机制的研究取得了一定的成果，但由于乳酸菌个体差异性比较大，所以共生机制的研究一直比较缓慢，对某些在共生过程中发生变化的机理仍然没有得到全面的了解。但是，我们深信伴随着生物技术的不断发展，人们可以运用更为先进的手段对乳酸菌的共生机制进行大量而全面的研究，从而为乳酸菌的选育与应用提供更为广阔的空间。
《中国乳品工业》 2011年12期
包维臣 陈霞 邵玉宇 乌兰 张兴昌 刘娜 曾凤泽 伊利那·塞日波纳·哈玛耶娃 齐齐格玛·达西耶那·扎木斯日诺娃 孙天松【摘要】：乳酸菌在乳中的共生机制是非常复杂的网络体系。通过对蛋白质代谢、核苷酸碱基代谢、氧化性应激以及碳源物质代谢等方面的研究,对保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌共生机理的研究进展进行详细的阐述。旨在为发酵剂菌体的筛选及应用提供参考。【作者单位】： 内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室;俄罗斯东西伯利亚州立技术大学;【关键词】： 保加利亚乳杆菌嗜热链球菌共生机理
