爱华网一、实验用设备：
1、离心机 1台*（3000转 离心红细胞）
2、冰箱 1台*（存放抗原）
3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板）
4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规厂家进。
5、96孔V型板 稀释血清 清洗后可重复使用
6、八道移液器 1把（5-50微升 稀释血清）
7、吸头和八道移液器配套使用，清洗后重复使用）
8、积液槽配制4个单位抗原及盛放生理盐水加样用
9、一次性采血管 采血用
10、2毫升注射器 采血用
11、红细胞非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用。
12、柠檬酸三钠 配制3.8％抗凝剂用
13、重铬酸钾 配制清洁液用
14、硫酸 配制清洁液用
15、吸管 1毫升、10毫升
16、吸耳球 和吸管配套使用
17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采大鸡）
18、蒸馏水 当地买。清洗96孔V型板、吸头用
19、10毫升离心管 离心红细胞用 （塑料制）
20、生理盐水 做血清稀释液用、配制4单位抗原
二、实验前的准备：
1.抗原：从指定厂家购买稳定浓缩抗原。
2.抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。
3.1％红细胞悬液：由鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内（按抗凝剂：全血＝1：2的比例），迅速混匀。在离心机中以3000转/分离心5分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中3000转/分离心5分钟，弃去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心4～5次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。放入4℃冰箱中可保存2—3天。使用时用1ml吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加入9.9ml的生理盐水，此即1%红细胞悬液。现用现配。
4.被检血清：每只鸡心脏或翼下采血0.5-1ml,静置或离心，待血清析出后备用。
5.吸管清洁液的配制：使用1%的稀硫酸溶液。水10公斤，硫酸100毫升，将硫酸慢慢倒入水中，不断搅拌，操作时必须戴手套，口罩。
6.96孔V型板和微量滴头清洁液的配制：重铬酸钾79克，水1000ml，硫酸100ml，将重铬酸钾磨碎，溶解于水中，然后慢慢加入硫酸100ml，不断搅拌，切不可将重铬酸钾水溶液倒入硫酸中，以防爆炸，操作时必须戴手套，口罩。
7.血清稀释液：为灭菌的生理盐水。
三、实验过程：
原理：某些病毒（如新城疫、减蛋、流感）能够与鸡红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象。这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验（HI）。
应用：1、检测血清中的抗体水平，确定免疫时机。2、免疫后及时监测，确认免疫效果。3、辅助诊断病毒性疾病。
包括血凝（HA）试验、抗原校正和血凝抑制（HI）试验三步：
（一）血凝（HA）试验：采用96孔V型反应板，测定抗原效价
1、首先用微量移液器向反应板的每孔加生理盐水25微升。
2、用微量移液器吸取待测抗原25微升于第一孔中并挤压6次混合，后吸出25微升至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，弃去25微升。
3、微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入各孔，每孔25微升。
4、置于微量振荡器上振荡1分钟。
5、室温静置30分钟后观察结果。
6、结果观察：将反应板倾斜成45度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原滴度红细胞凝集效价。即沉淀的前一孔即为该抗原的效价。如彩图1所示第8孔红细胞为完全凝集，说明该抗原效价为1：256。
彩图1：
图1 抗原效价为1：256
（二）4单位抗原校正：
1、根据抗原效价结果配制相应比例的抗原稀释液：即4单位抗原。
例：上图1：抗原效价为1：256，HI试验时，25微升抗原稀释液内须含4个凝集单位，则应将抗原作256/4=64倍稀释。即取0.1毫升抗原，加入6.4毫升生理盐水。
2、首先用微量移液器向反应板的第二孔至第六孔加生理盐水25微升。第一孔不加。
3、用微量移液器吸取4单位抗原25微升分别加入第一孔、第二孔中，从第二孔开始挤压6次混合，后吸出25微升至第3孔，依次倍比稀释到第5孔，弃去25微升。
4、用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1-6孔，每孔25微升。
5、于微量振荡器上振荡1分钟。
6、室温静置30分钟后观察结果。
7、结果观察：第一、二、三孔为完全凝集，第四孔红细胞为50%沉淀，第五孔为对照完全沉淀，如果出现以上结果，表明所配4单位抗原准确，校正成立。如彩图2所示。
彩图2：
图2前三孔为红细胞完全凝集，第四孔为红细胞50％凝集，第五孔为红细胞完全沉淀，说明该次抗原校正成立
（三）血凝抑制（HI）试验：每排孔检查1份血清。步骤如下：
1.用微量移液器先加25微升生理盐水于各孔中。
2.用微量移液器吸取待检血清25微升置于第1孔中，然后倍比稀释至第11孔，弃去25微升。最后一孔不稀释，为红细胞对照。
3.用微量移液器吸取配制好的抗原，每孔25微升。
4.置于微量振荡器上振荡1分钟，混合均匀。
5.室温静置20分钟。
6.用微量移液器吸取1%红细胞悬液于每孔各加25微升。
7.置于微量振荡器上振荡1分钟，混合均匀。
8.室温静置40分钟后观察结果。
四、结果判定：
1）判定结果：以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的HI滴度，以2的指数表示。见彩图3：
图3 上图抗体结果从上至下依次为：8/7/8/9/8/7/7/6
2）判定标准：
1.新城疫抗体：育雏育成鸡在7以上，产蛋鸡在9以上。
2.H5抗体：抗体值在6以上。
3.H9抗体：抗体值在7以上。
注：低于以上标准，则需要进行免疫。
3)免疫后抗体规律
一般活疫苗免后7-10天产生抗体，2-3周抗体到达峰值，可以维持2个月。灭活疫苗免后10-15天产生抗体，3-4周抗体到达峰值，可以维持3-4个月。
五、实验后的用具处理：
1、96孔V型反应板的清洗：
新反应板可直接放入清洁液中浸泡24小时，用过的反应板先用流水冲净孔中的反应物，然后泡在清洁液中，24小时后捞出，甩掉清洁液，放入流水中冲洗干净后，在蒸馏水中冲洗一遍，甩干，摆放在恒温箱中，烤干备用。属塑料制品，70℃以下烤干。
2、微量滴头的清洗：
新滴头直接放入清洗液中浸泡，用过的用清水冲洗掉滴头中的血清后浸泡在清洁液中，最少浸泡24小时，捞出后用流动水冲洗掉滴头内外的清洁液，然后在蒸馏水中冲洗一遍，甩干，放入恒温箱中烤干，备用。属塑料制品，70℃以下烤干。
3、吸管及积液槽的清洗：
将吸管及积液槽直接浸泡在清洁液中，24小时后捞出，用流动水冲洗干净后在蒸馏水中再冲洗一遍，甩干，吸管放入高温干燥箱中160℃干燥1—2小时后备用，玻璃制品可高温烤干。积液槽放入恒温箱中烘干。
[温馨提示]：指出为啥要用公鸡的红细胞呢？母鸡的不可以吗？
一般情况下健壮的公鸡比健壮的母鸡活动强、新陈代谢旺盛、需要氧气量更多，所以健壮的公鸡比健壮的母鸡血液的输氧能力强，血红蛋白的含量和红细胞的数量都更多，另外，成年公鸡比幼年公鸡的红细胞也要多，所以收集红细胞采血时选择健康成年公鸡。正常情况下，血红蛋白含量（克/100毫升）：公鸡11.76，母鸡9.11；红细胞数（百万/立方毫米）：公鸡3.23，母鸡2.72。这在一般的动物生理学教材上家禽生理章节的血液部分会找到，可参阅。不是说母鸡的红细胞完全不可以使用，但公鸡红细胞与母鸡红细胞存在一定的差异，上述刘老师已经提到，另外，母鸡红细胞确实存在易出现非特异性自凝的现象，这些是在长期的实验中发现的。更为重要的是，关于禽流感和新城疫的血清学诊断方法，农业部均颁布了技术规范，具体可参考《高致病性禽流感防治技术规范》等14个动物疫病防治技术规范。如果我们在试验操作时没有完全按照技术规范或国家标准来执行，那么在结果判定时就需要根据技术规范或国家标准对结果进行修正。而结果的修正是需要具有很丰富的实践经验的。也正因如此，国家和部委才制定了相应的标准，便于统一判定。
