细胞内DNA复制的引物与PCR引物有何区别? 共享引物pcr

观点:不同。DNA在细胞内复制引物是RNA短链,在体外扩增(PCR)需要DNA单链引物。观点来自:

“聚合酶只能催化脱氧核糖核苷酸加到已有核酸链的游离3'-羟基上,而不能使脱氧核糖核苷酸自身发生聚合,也就是说,它需要引物链(primerstrand)的存在.”“综上所述,DNA聚合酶的反应特点为:……反应需要有引物3'-羟基存在……”
“与其他种类的DNA聚合酶一样大肠杆菌DNA聚合酶I只能在已有核酸链上延伸DNA链,而不能从无到有开始DNA链的合成,也就是说,它催化的反应需要有引物链(DNA链或RNA链)的存在。”(本人注:主要起复制作用的是DNA聚合酶III,不过它同样需要有3'-OH的引物链存在)
“如前所述,所有已知的DNA聚合酶都不能发动新链的合成,而只能催化已有链的延长反应。然而RNA聚合酶则不同,它只需要DNA模板存在,就可以在其上合成出新的RNA链。这就是说,DNA合成需要引物,RNA合成不需要引物。那么,每一个冈崎片段是怎样开始合成的?它的引物是什么?现在知道,在DNA模板上需先合成一段RNA引物(催化该反应的酶称为引物合成酶。引物的长度通常是几个核苷酸至10多个核苷酸,DNA聚合酶III可在其上聚合脱氧核糖核苷酸,直至完成冈崎片段的合成。RNA引物的消除和缺口的填补是由DNA聚合酶I来完成的。最后由DNA连接酶将冈崎片段连成长链。),DNA聚合酶从RNA引物的3'-OH端开始合成新的DNA链。”
“DNA的体外酶促合成必须加入少量的DNA才能进行。由于DNA在提取过程中常受到机械切力或酶的作用,从而引起磷酸二酯键的断裂。……显露出3'-羟基的核酸链可作为引物,链延长的信息来自对应的互补链。由此可见,在DNA聚合酶反应中,加入的DNA同时起两者作用:一条链作为引物,另一条链作为模板。”

以上引自:王镜岩等.生物化学(下册).高等教育出版社.第三版.412~418。
寡聚核苷酸的化学合成不需要引物(根据王镜岩等.生物化学(下册).高等教育出版社.第三版.598所述推定)。

附:DNA复制进程大抵可以分为复制的引发,DNA链的延伸和DNA复制的停止三个阶段。
(一)DNA复制的引发
复制的引发(Priming)阶段包罗DNA复制终点双链解开,经过转录激活步调分解RNA分子,RNA引物的分解,DNA聚合酶将第一个脱氧核苷酸加到引物RNA的3'-OH末了复制引发的要害步调便是前导链DNA的分解,一旦前导链DNA的聚协作用开端,滞后链上的DNA分解也随着开端,在一切前导链开端聚合之前有一必须的步调便是由RNA聚合酶(不是引物酶)沿滞后链模板转录一短的RNA分子。在有些DNA复制中,(如质粒ColE),该RNA分子颠末加式成为DNA复制的引物。但是,在大局部DNA复制中,该RNA分子没有引物作用。它的作用好像只是离开两条DNA链,表露出某些特定序列以便引发体与之联合,在前导链模板DNA上开端分解RNA引物,这个进程称为转录激活(transcriptionalactivation),在前导链的复制引发进程中还需求其他一些卵白质,如大肠杆菌的dnaA卵白。这两种卵白质可以和复制终点处DNA上高度激进的4个9bp长的序列联合,其详细功用尚不清晰。能够是这些卵白质与DNA复制终点联合后能促进DNA聚合酶Ⅲ复合体的七种卵白质在复制终点处拆卸成有功用的全酶。DNA复制开端时,DNA螺旋酶起首在复制终点处将双链DNA解开,经过转录激活分解的RNA分子也起别离两条DNA链的作用,然后单链DNA联合卵白质联合在被解开的链上。由复制因子X(n卵白),复制因子Y(n'卵白),n"卵白,i卵白,dnaB卵白和dnaC卵白等6种卵白质构成的引发前体(preprimosome),在单链DNA联合卵白的作用下与单链DNA联合天生两头物,这是一种前引发进程。引发前体进一步与引物酶(primase)组装成引发体(primosome)。引发体可以在单链DNA上挪动,在dnaB亚基的作用下辨认DNA复制终点地位。起首在前导链上由引物酶催化分解一段RNA引物,然后,引发体在滞后链上沿5'→3'偏向不绝的挪动(这是一种绝对挪动,也能够是滞后链模板在挪动,见后),在肯定间隔上重复分解RNA引物供DNA聚合酶Ⅲ分解冈崎片断运用,引发体中很多卵白因子的功用尚不清晰。但是,这些成份必需协同任务才干使引发体在滞后链上挪动,辨认适宜的引物分解地位,并将核苷酸在引发地位上聚分解RNA引物。由于引发体在滞后链模板上的挪动偏向与其分解引物的偏向相反,以是在滞后链上所分解的RNA引物十分短,普通只要3-5个核苷酸长。并且,在统一种生物体细胞中这些引物都具有类似的序列,标明引物酶要在DNA滞后链模板上比拟特定的地位(序列)上才干分解RNA引物。
为什么需求有RNA引物来引发DNA复制呢?这能够只管即便增加DNA复制肇始处的渐变有关。DNA复制开端处的几个核苷酸最容易呈现过失,因而,用RNA引物即便呈现过失最初也要被DNA聚合酶Ⅰ切除,进步了DNA复制的精确性。RNA引物构成后,由DNA聚合酶Ⅲ催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补准绳加在RNA引物3'-OH端而进入DNA链的延伸阶段。
(二)DNA链的延伸
DNA重生链的分解由DNA聚合酶Ⅲ所催化,但是,DNA必需由螺旋酶在复制叉处边挪动边解开双链。如许就发生了一种拓扑学上的题目:由于DNA的解链,在DNA双链区势必发生正超螺旋,在环状DNA中更为分明,当到达肯定水平后就会形成复制叉难再持续行进,从而停止DNA复制。但是,在细胞内DNA复制不会因呈现拓扑学题目而中止。有两种机制可以避免这种景象发作:[1]DNA在生物细胞中自身便是超螺旋,当DNA解链而发生正超螺旋时,可以被原来存在的负超螺旋所中和;[2]DNA拓扑异构酶Ⅰ要以翻开一条链,使正超螺旋形态变化成松懈形态,而DNA拓扑异构酶Ⅱ(旋转酶)可以在DNA解链后方不绝地持续将负超螺旋引入双链DNA。这两种机制包管了无论是环状DNA照旧开环DNA的复制顺遂的解链,再由DNA聚合酶Ⅲ分解新的DNA链。前已述及DNA生长链的延伸次要由DNA聚合酶催化,该酶是由7种卵白质(多肽)构成的聚合体,称为全酶。全酶中一切亚基对完成DNA复制都是必须的。α亚基具有聚合功用和5'→3'外切酶活性,ε亚基具有3'→5'外切酶活性。别的,全酶中另有ATP分子它是DNA聚合酶Ⅲ催化第一个脱氧核糖核苷酸衔接在RNA引物上所必须的,其他亚基的功用尚不清晰。
在DNA复制叉处要能由两套DNA聚合酶Ⅲ在统一工夫辨别停止复制DNA前导链和滞后链。假如滞后链模板盘绕DNA聚合酶Ⅲ全酶,并经过DNA聚合酶Ⅲ,然后再折向与未解链的双链DNA在统一偏向上,则滞后链的分解可以和前导链的分解在统一偏向上停止。
如许,当DNA聚合酶Ⅲ沿着滞后链模板挪动时,由特异的引物酶催化分解的RNA引物即可以由DNA聚合酶Ⅲ所延伸。当分解的DNA链抵达前一次分解的冈崎片断的地位时,滞后链模板及刚分解的冈崎片断便从DNA聚合酶Ⅲ上开释出来。这时,由于复制叉持续向前活动,便发生了又一段单链的滞后链模板,它重新盘绕DNA聚合酶Ⅲ全酶,并经过DNA聚合酶Ⅲ开端分解新的滞后链冈崎片断。经过如许的机制,前导链的分解不会超越滞后链太多(最初只要一个冈崎片断的长度)。并且,如许引发体在DNA链上和DNA聚合酶Ⅲ以统一速率挪动。
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按上述DNA复制的机制,在复制叉左近,构成了以两套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引发体和螺旋组成的相似核糖体巨细的复合体,称为DNA复制体(replisome)。复制体在DNA前导链模板和滞后链模板上挪动时便分解了延续的DNA前导链和由很多冈崎片断构成的滞后链。在DNA分解延伸进程中次要是DNA聚合酶Ⅲ的作用。当冈崎片断构成后,DNA聚合酶Ⅰ经过其5'→3'外切酶活性切除冈崎片断上的RNA引物,同时,应用后一个冈崎片断作为引物由5'→3'分解DNA。最初两个冈崎片断由DNA衔接酶将其接起来,构成完好的DNA滞后链。
(三)DNA复制的停止
过来以为,DNA一旦复制开端,就会将该DNA分子全部复制终了,才停止其DNA复制。但近来的实行标明,在DNA上也存在着复制停止位点,DNA复制将在复制停止位点处停止,并纷歧定等全部DNA分解终了。但现在对复制停止位点的构造和功用理解甚少在NDA复制停止阶段令热ナ困惑的一个题目是,线性DNA分子两头是怎样完成其复制的?已知DNA复制都要有RNA引物到场。当RNA引物被切除后,两头所遗留的间隙由DNA聚合Ⅰ所添补。但是,在线性分子的两头以5'→3'为模板的滞后链的分解,其末了的RNA引物被切除后是无法被DNA聚合酶所添补的。
在研讨T7DNA复制时,这个题目局部地失掉理解决。T7DNA两头的DNA序列区有160bp长的序列完全相反。并且,在T7DNA复制时,发生的子代DNA分子不是一个单元T7DNA长度,而是很多单元长度的T7DNA首尾衔接在一同。T7DNA两个子代DNA分子都市有一个3'端单链尾巴,两个子代DNA的3'端尾巴以互补联合构成两个单元T7DNA的线性衔接。然后由DNA聚合酶Ⅰ添补和DNA衔接酶衔接后,持续复制便构成四个单元长度的T7DNA分子。如许复制下去,便可构成多个单元长度的T7DNA分子。如许的T7DNA分子可以被特异的内切酶切开,用DNA聚合酶添补与亲代DNA完全一样的双链T7DNA分子。
在研讨痘病毒复制时,发明了线性DNA分子完成末了复制的第二种方法。痘病毒DNA在两头都构成发夹环状构造。DNA复制时,在线性分子两头的一个复制终点开端,双向停止,将发夹环状构造酿成双链环状DNA。然后,在发夹的地方将差别DNA链切开,使DNA分子变性,双链离开。如许,在每个分子两头构成一个单链尾端要以自我互补,构成完好的发夹构造,与亲代DNA分子一样。在真核生物染色体线性DNA分子复制时,尚不清晰末了的复制进程是怎样停止的。也能够像痘病毒那样构成发夹构造而停止复制。但近来的实行标明,真核生物染色体末了DNA复制是由一种特别的酶将一个新的末了DNA序列加在方才完成复制的DNA末了。这种机制起首在四膜虫中发明。该生物细胞的线性DNA分子末了有30-70拷贝的5'TTGGGG3'序列,该细胞中存在一种酶可以将TTGGGG序列加在事前已存在的单键DNA末了的TTGGGG序列上。如许有较长的末了单链DNA,可以被引物酶重新引发或其他的酶卵白引发而分解RNA引物,并由DNA聚合酶将其酿成双链DNA。如许就可以防止其DNA随着复制的不时停止而逐步变短。
在环状DNA的复制的末了停止阶段则不存在上述题目。环状DNA复制到最初,由DNA拓扑异构酶Ⅱ切开双链DNA,将两个DNA分子离开成为两个完好的与亲代DNA分子一样的子代DNA。

  

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