单增李斯特菌 副溶血弧菌

单增李斯特菌的调查报告

一、单增李斯特菌的概述

生活中李斯特菌到处存在,但其中只有一种为致病菌。李斯特菌可从各种食品样本中分离出来包括乳制品、肉类、蔬菜和海鲜,也可从食品加工过程中的环境中分离而来。

李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染,很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌,并制定了相应的标准。目前国际上公认的李斯特菌共有七个菌株:

(1)单核细胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes/L.mono)

(2)绵羊李斯特菌 (Listeria iuanuii)

(3)英诺克李斯特菌(Listeria innocua)

(4)威尔斯李斯特菌(Listeria welshimeri)

(5)西尔李斯特菌 (Listeria seeligeri)

(6)格氏李斯特菌 (Listeria grayi)

(7)默氏李斯特菌 (Listeria murrayi)

其中单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes/L.mono)是唯一能引起人类疾病的。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病,感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中,食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险,该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖,是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。

在美国LM被列为7种主要的食源性致死病菌之一,已经被WHO食品安全工作计划列为重点检测的食源性病原菌之一。LM为需氧或兼性厌氧菌,生长温度为1~45℃,对不利环境具有较强的耐受能力,在4℃冰箱中也可生长繁殖,在pH5.0~9.0的环境中,1年后仍可检出,这使其危害性进一步增大。另外,LM病原体定居在细胞内,因此应用抗生素治疗效果不理想。由于LM引起的疾病及其食源性感染日益引起世界各国的重视,对该病建立快速、灵敏、准确的检测是有效防治本病、诊断病原菌和保证食品卫生安全的重要手段。

二、单增李斯特菌的检测方法

(1)平板培养法(国标):用不同浓度的沙门菌菌悬液人工染菌二类食品各4o份,用增菌液两步增菌,两种分离培养基分离,对比检出率及分离效果。检出率62.5%,最低检出限为0.5cfu/25g一13cfu/25g。

(2)显色培养基:上海欢奥科贸有限公司

(3)PCR试剂盒:生物梅里埃的检测系统、杜邦:BAX®系统检测法,BAX®系统的单增李斯特菌检测法的灵敏度和特异性比率达到了98%,,并通过USDA-FSIS和AOAC国际的认证,成为官方检测法。

美国伯乐iQ-Check单增李斯特菌的检测:iQ-Check系统采用了所有的实时荧光PCR方法的优点为食品中病原微生物提供快速和可靠地检测解决方案。iQ-Check试剂盒为食品和环境样品中的单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)定性检测试剂盒。

陆桥:

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)荧光定量PCR检测试剂盒1680 48T

索奥:

单增李斯特菌(LM)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

(4)胶体金快速检测卡:无锡中德伯尔生物技术有限公司

(5)单增李斯特菌ELISA检测试剂盒:德国拜发(苏微有代理)

三、单增李斯特菌抗体的制备

(1)单增李斯特菌(Listeriamonocytogens)鸡卵黄抗体的制备

菌体抗原的制备动物免疫特异性IgY的提取,最好的用硫酸铵盐析法

(2)单核增生李斯特菌InternalinA的克隆表达与抗体制备

InternalinA是单核增生李斯特菌独有的表面蛋白,是参与病菌黏附入侵上皮细胞的主要因子。InlA是含有800个氨基酸的蛋白,它富含亮氨酸高度重复区域(LRR),LRRs内部的重复结构区对于InlA识别上皮细胞的黏附位点尤为关键,侵染时,可能是LRR区域直接与上皮细胞的E-钙粘蛋白作用。另外,InlA的C端存在的LPXTG保守模体使此蛋白与李斯特菌细胞表面的肽聚糖连接,故使InlA呈现于菌体的外表面。InlA作为单核增生李斯特菌的特征性抗原引起了国外学者的关注,制备其多克隆抗体,进行免疫学检测是研究的一个热点。目前国内尚没有相关的研究报道。

克隆表达单核增生李斯特菌InternalinA(InlA),并以之为抗原制备检测单核增生李斯特菌的抗体。通过PCR技术从单核细胞增生李斯特菌中扩增出inlA基因,克隆筛选和测序鉴定后,最终构建该基因的原核表达质粒pGEX-4T-InlA,谷胱甘肽树脂亲和层析纯化表达产物后,免疫小鼠分别制备相应的多抗和单抗。

(3)单增李斯特菌ActA的表达、免疫原性研究及单克隆抗体的制备原核表达单增李斯特菌(Lm)ActA蛋白并进行亲合层析纯化,检测ActA的免疫原性,以表达蛋白为检测抗原制备Lm单克隆抗体,并对单抗的亚型、效价、亲合力及特异性进行测定。

(4)以纯化的单核细胞增生李斯特菌为抗原,免疫Balb/c小鼠,制备单克隆抗体。(胶体金标记单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的制备)

单克隆抗体的纯化:小鼠腹水可通过亲和层析方法获得所需的纯化单克隆抗体。

小鼠腹水可通过饱和硫酸铵盐析、D-SaltTM脱盐柱、IgM纯化试剂盒获得。

(5)以Lm为免疫抗原免疫Balb/c小鼠,待小鼠效价达到要求后,按照常规方法进行细胞融合,以纯化的ActA(肌动蛋白聚合蛋白)蛋白为检测抗原筛选杂交瘤细胞,采用有限稀释法进行克隆。

单增李斯特菌 副溶血弧菌

(6)建立胶体金免疫层析技术快速定量检测单增李斯特菌方法

该法可在10min内完成定性和半定量检测,定量检测灵敏度为3.5×103cfu/ml,线

性范围3.5×105-3.5×108cfu/ml,回收率在99%-101.7%之间。

单增李斯特菌P60多克隆抗体(Listeria monocytogenes,multiple cloning antibody ofP60由吉林出入境检验检疫局提供)、羊抗兔IgG(购自鼎国生物技术公司)。

  

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