如何阅读质粒图谱 开放阅读框

一、载体主有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。

一、一个合格质粒的组成要素

复制起始位点Ori,即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。

抗生素抗性基因:可以便于加以检测,如Amp+,Kan+

多l克隆位点:MCS克隆携带外源基因片段

P/E:启动子/增强子

Terms:终止信号

加poly(A)信号:可以起到稳定mRNA作用

二、如何阅读质粒图谱

第一步:首先看Ori的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)

Ori的箭头指复制方向,其他元件标注的箭头多指转录方向(正向)。

第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记:

(1)Ampr:水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。

(2)tetr:可以阻止四环素进入细胞。

(3)camr:生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。

(4)neor(kanr):氨基糖苷磷酸转移酶,使G418(卡那霉素衍生物)失活。

(5)hygr:使潮霉素β失活。

第三步:看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点,便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步:再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。

第五步:是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。

相关概念

启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号

启动子-促进DNA转录的DNA顺序,这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游,是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录。

增强子/沉默子-为真核l基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。沉默子-负增强子,负调控序列。

核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是AUG(起始密码)和SD序列。

l转录终止顺序(终止子)/翻译终止密码子:结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down-stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly(A)加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down-stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly(A)加尾信号。

三、载体及其分类

载体:即要把一个有用的基因(目的基因——研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体(vector)。

P.S.基因工程所用的vector实际上是DNA分子,是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA。

载体的分类

按功能分成:(1)克隆载体:都有一个松弛的复制子,能带动外源基因,在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段(基因)的载体。(所以有时实验时扩增效率低下,要注意是不是使用的严谨型载体)(2)表达载体:具有克隆载体的基本元件(ori,Ampr,Mcs等)还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。
按进入受体细胞类型分:(1)原核载体(2)真核载体(3)穿梭载体(sbuttlevector)指在两种宿主生物体内复制的载体分子,因而可以运载目的基因(穿梭往返两种生物之间)。P.S.穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子,以确保两类细胞中都能扩增。

基因工程载体的3个特点:

(一)都能独立自主的复制:载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域,如MCS,插在其中的外源DNA片段,能被动的跟着载体一起复制/扩增,就像载体的正常成分一样。

(二)都能便利的加以检测:如载体的药物抗性基因,多是抗生素抗性基因,将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时,只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。

(三)都能容易进入宿主细胞中去,也易从宿主细胞中分离纯化出来。

四、载体的选择和制备

选择载体主要依据构建的目的,同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因,则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点:

1、构建DNA重组体的目的,克隆扩增/表达表达,选择合适的克隆载体/表达载体。

2、载体的类型:

(1)克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小(大选大,小选小)。如<10kb选质粒。

(2)表达载体据受体细胞类型-原核/真核/穿梭,E.coli/哺乳类细胞表达载体。

(3)对原核表达载体应该注意3点:

①选择合适的启动子及相应的受体菌;

②用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位;

③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

3、载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接,不产生阅读框架错位。选用质粒(最常用)做载体的4点要求:

①选分子量小的质粒,即小载体(1-1.5kb)→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多

(也有大载体);

②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般10个以上的拷贝,而严谨型

质粒<10个。

③必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地;

④必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因,不特指多位Ampr(试一试)。

无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子,然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割,获得分子,以便于与目的基因片段进行连接。

二、pET32a(+)自身载体表达的片段大小

The expected fusion protein expressedencoded by just the pET-32a(+) vector alone would be around 20.4kDa. The Trx-tag by itself would contribute 12kDa. The rest is dueto the two His-tags (0.8kDa each) and the S-tag (1.7kDa). Theremaining 5.1kDa is due to the intervening(?)54amino acids between the tags and until the stopcodon.

三、pET32系列载体的载体序列地址

pET-32a(+) Vector Sequence
http://www.embl-hamburg.de/~geer... ET/pET-32a_seq.html
pET-32b(+)VectorSequence
http://www.embl-hamburg.de/~geer... ET/pET-32b_seq.html
pET-32c(+) VectorSequence
http://www.embl-hamburg.de/~geer... ET/pET-32c_seq.html

四、pET系列载体阅读方法

ori是复制起始点,细的黑箭头是几个不同的转录区,其箭头方向不同,说明每个表达产物(如kan抗性基因、LacI等)都有独立的promoter,有时与T7 promoter方向相反。粗的黑箭头是MCS,用于目的基因的插入,箭头方向表明目的基因的转录方向,它的转录方向可以与其它几个不同的转录区相同,也可以不同,如Kan抗性基因、La————cI的方向是一样的,可能与调控相关,不同的载体是不一样的。一个载体可只看它的启动子到终止子那一段,其它的可以考虑少些。

五、pET表达菌株的相关信息

(DE3)指宿主为λDE3溶原菌,其染色体上带有一拷贝由lacUV5启动子控制的T7RNA聚合酶基因。这类菌株适用于从克隆到pET载体的目标基因生产蛋白。命名为pLysS和pLysE的宿主菌带有编码T7溶菌酶(为T7RNA聚合酶的天然抑制物)的pET相容性质粒。带有pLysS的细胞产生少量溶菌酶,而pLysE宿主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制T7RNA聚合酶的基础表达,这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的pET重组体。带有pLacI的宿主菌产生额外的抑制pETBlue和pTriEx载体基础表达的lac阻遏蛋白。λDE3溶原化试剂盒用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。
AD494菌株为硫氧还蛋白还原酶( trxB)突变菌株,能够在胞浆内形成二硫键,提供了生产正确折迭的活性蛋白的潜力。TrxB突变可用卡那霉素选择,因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla的质粒。
B834为BL21的亲本菌株。这些蛋白酶缺陷宿主菌为甲硫氨酸营养缺陷型,可用35S-甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记,从而用于结晶学研究。
BL21应用最广的宿主菌来源,具有lon和ompT蛋白酶缺陷的优点。
BL21TrxB菌株在蛋白酶缺陷BL21背景上具有与AD494菌株相同的硫氧还蛋白还原酶突变( trxB)。由于trxB宿主有利于胞浆内二硫键形成,它们的使用可增加正确折迭的蛋白组分。TrxB突变可用卡那霉素选择,因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla的质粒。
BLR为BL21的recA-衍生菌株,能够改善质粒单体产量,有助于稳定含有重复序列或其产物能够引起DE3噬菌体丢失的目标质粒。
HMS174菌株在K-12背景上提供了recA突变。与BLR一样,这些菌株能够稳定其产物能够引起DE3噬菌体丢失的某些目标基因。
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NovaBlue适合用作初始克隆宿主菌的K-12菌株,具有高转化效率、蓝/白斑筛选能力(与合适质粒)和导致优质质粒DNA高产的recAendA突变。由于存在F附加体编码的lacIq阻遏蛋白,NovaBlue的DE3溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。
Origami为K-12衍生的宿主菌,硫氧还蛋白还原酶突变( trxB)和谷胱甘肽还原酶( gor)基因均为突变,能够大大增强胞浆内二硫键的形成。研究表明即使总体表达水平相似,Origami(DE3)表达的活性蛋白比其它宿主菌高10倍以上。Origami宿主菌与氨苄抗性质粒相容,可用于pET-32载体,硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。TrxB和gor突变可分别用卡那霉素和四环素选择,因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla的pET质粒。
OrigamiB宿主菌来源于BL21lacZY突变株,还带有与原始Origami菌株相同的TrxB /gor突变。OrigamiB菌株集BL21、Tuner和Origami宿主菌的优点于一体。TrxB和gor突变可分别用卡那霉素和四环素选择,因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla的pET质粒。
Rosetta宿主菌从BL21衍生而来,可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs。这样Rosetta菌株提供了“万能”的翻译,从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。tRNA基因由它们的天然启动子驱动。在Rosetta(DE3)pLysS和Rosetta(DE3)pLacI中,稀有tRNA基因存在于分别带有T7溶菌酶和lac阻遏基因的同一质粒上。
Tuner菌株为BL21的lacZY缺失突变株,能够调整培养物中所有细胞的蛋白表达水平。lac通透酶(lacY)突变使得IPTG均匀进入群体所有细胞,从而具有浓度依赖、水平均一的诱导表达。通过调整IPTG浓度,表达可从极低水平调节到极强、完全诱导的表达水平(通常与pET载体相关)。低水平表达有时可能增强难表达蛋白的溶解性和活性。Tuner(DE3)pLacI菌株与pETBlue和pTriEx载体的表达相容。

六、pGEX载体的特点

pGEX特点就是带有GST标签,可以增加目的蛋白的溶解度,别的没什么特点,属于大众型载体,目前也较常使用。

  

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