爱华网[实验原理]
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶（可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率低）和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有互补粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有—种大肠杆菌连接 酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物；然后，酶—AMP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过(牛小肠碱性磷酸酶)CIP处理克服。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-16h(过夜)，这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
[仪器、材料与试剂]
恒温摇床、 紫外线透射仪、移液枪、pH计、电泳槽、T4DNA连接酶、T4DNA连接酶缓冲液、载体 、目的DNA片段
[实验步骤]
1、在微型离心管中混合以下试剂：
试剂体积（uL）
目的DNA4
载体分子1
T4DNA连接酶及缓冲液5
2、混合液于16℃保温2-4h或过夜，取2uL做电泳检查，鉴定反应连接产物，做完DNA重组后，暂放冰箱保存，迅速做转化实验
