重组质粒的构建(实验原理) 同源重组载体构建原理

[实验原理]

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种:T4噬菌体DNA连接酶(可用于连接粘性末端和平末端,但连接效率低)和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有互补粘性末端的DNA分子连在一起的功能,而且T4噬菌体DNA连接酶还有—种大肠杆菌连接 酶没有的特性,即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步:首先,T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物;然后,酶—AMP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化;最后产生一个新的磷酸二酯键,把切口封起来。

DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法,为了防止载体本身的自连,可以通过(牛小肠碱性磷酸酶)CIP处理克服。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下,粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度,即12-16℃,连接12-16h(过夜),这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳定。

[仪器、材料与试剂]

恒温摇床、 紫外线透射仪、移液枪、pH计、电泳槽、T4DNA连接酶、T4DNA连接酶缓冲液、载体 、目的DNA片段

[实验步骤]

1、在微型离心管中混合以下试剂:

重组质粒的构建(实验原理) 同源重组载体构建原理

试剂体积(uL)

目的DNA4

载体分子1

T4DNA连接酶及缓冲液5

2、混合液于16℃保温2-4h或过夜,取2uL做电泳检查,鉴定反应连接产物,做完DNA重组后,暂放冰箱保存,迅速做转化实验

  

爱华网本文地址 » http://www.413yy.cn/a/25101015/284288.html

更多阅读

质粒与载体 puc系列质粒载体

最近改造一个穿梭质粒发现了问题,可能主要是由于不同菌种中启动区域不一样的原因吧~~!看了看质粒的构建方面的文章,觉得要是重头构建一个质粒还真不容易,质粒的复制起始位点啊,表达盒啊,搜到这篇基础却又很重要的文章。所有构建质粒的同学开

海波与蜡的熔化实验录像 海波的熔化实验视频

晶体与非晶体的熔化实验是热学中的一个难点,晶体的选择有许多种,海波、冰、萘都是可以选择的实验晶体。由于萘有毒,不溶于水,实验完成后不方便处理。冰熔化时一般无需加热就能够熔化,如果再用酒精灯加热,温差太大,不利于实验的准确性。选择

相机成像与背景虚化原理 相机的成像原理

最近迷上了摄影,除买了单反相机,也看了不少摄影书。由于长期读书落下的“毛病”,非要把相关成像原理研究个水落石出,经过查阅资料和思考,基本想通了相机的成像、虚化和景深的原理。这里借助其他爱好摄影的研究资料,对相机的成像和虚化原理

硫化锌的制备实验报告 阿司匹林制备实验报告

硫化锌的制备实验报告实验日期:2012年2月7日实验地点:辽宁省沈阳市某郊区楼道室温:19℃【实验目的】1.认识硫单质的弱氧化性2.制备硫化锌留用3.观察硫与锌反应的现象【实验原理】硫与锌在点燃的条件下发生氧化还原反应,硫将锌氧

声明:《重组质粒的构建(实验原理) 同源重组载体构建原理》为网友忠誠且嬌憨分享!如侵犯到您的合法权益请联系我们删除