引物稀释方法:
1.OligoDNA是以OD260单位来计算的,这是指在1ml体积1cm光程标准比色皿中,260nm波长下吸光度为1A260的Oligo溶液定义为1OD260单位,根据此定义,1OD260单位相当于33ug的Ol igoDNA,您可以根据此数据和您的OligoDNA分子量,计算得到摩尔数以计算不同摩尔浓度的溶液。
2.引物序列的分子量计算公式如下:
MW=(A碱基数*312)+(C碱基数*288)+(G碱基数*328)+(T碱基数*303)-61
例如:引物TGGGCGGCGGTTGGTGTTACG A=1 C=3 G=11 T=6
MW=(1*312)+(3*328)+(6*303)-61=6541
3.Oligo DNA的分子量也可以用以下近似方法计算:Oligo DNA中的每个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近似为324.5,则一条Oligo DNA的分子量=碱基数*324.5。
例如:您得到一管标为5OD260的20mer Oligo DNA
分子量=20*324.5=6490
质量数=5*33=165ug
摩尔数=165/6490=0.025umol=25nmol
若加灭菌双蒸水400ul溶解,则浓度为25nmol/400ul=62.5uM
4.装有引物的eppendorf管一般保存于-20℃,临用前稀释。
5.由于Oligo DNA呈很轻的干膜状附在管壁上,打开时极易散失,所以打开管子前请先离心10000rpm,1min,然后再慢慢打开管盖。
6.在装有引物的eppendorf管内加入100-500ul双蒸水,盖上管盖,充分上下振荡5-10分钟,再次离心10000rpm,1min。
7.计算原引物管primer的浓度(必要时测OD260核对厂家提供引物量是否正确)
8.计算并将应用primer稀释为10pmol/ul。
9.标明原引物管、应用引物管、稀释方法,置-20℃保存。