爱华网2010版中国药典培训回答（第4部分：菌种传代与特定菌检测）
广东省药检所对《中国药典》2010版微生物专题培训班的有关问题解答答案。
http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20120415/3980531/
1.以第五代菌做阳性对照，实验过程中的接种按药典应该也算传代，那是否算是第六代菌呢？答：依然算第五代(接种的菌株算第5代，培养后算第6代)
答：其实验结果是算哪一代菌的？答：见上题
2.药典规定只能传代五次，此次实验结果是否有效？
答：有效
3.现在有无对照菌种可以购买？联络电话？
答：省药检所业务科销售药典规定的标准菌株，为第二代甘油冻存管，电话：020-81854392
4.菌种发放单应包括什么信息？
答：根据自己工作的需要，大致包括：菌种名称，编号，来源，接收日期，接收人等。
5.如何检查黑曲霉孢子悬浮液孢子含量为50~100个／ml。铜绿假单胞菌单菌如果用甘油冷冻管，也是低温，是否也会影响它的活性？应如何保存？
答：可用玫瑰红钠琼脂培养基或改良马丁琼脂来确定黑曲霉孢子悬浮液。铜绿假单胞菌应使用最终甘油浓度为20%的甘油冻存管保存，保存在-30℃或更低温度，则可保持其活性。若是斜面或营养肉汤，建议室温保存。
6.工作菌株，25℃下可连续使用一周，这里的工作菌株是指原液还是制备好的菌悬液。为何工作菌株不低温存放，而是25℃？
答：首先要说明，所有的操作应按药典要求来操作，这里的工作菌株指原液，工作菌株建议在2-8℃保存，但要注意的是，铜绿假单胞菌的工作菌液不能低温保存，低温会损伤其活性。由于笔误，写成了25℃，请更正为2-8℃。
7.简单方便的厌氧培养方案？
答：硫乙醇酸盐培养基；固体培养基的话可考虑使用一次性厌氧袋。
8.甘油冻存管一定要－30℃吗？0℃以下不可以吗？
答：详见《中国药品检验标准操作规范》2010版341页。我们的甘油冻存管保存在-30℃。
8.三糖铁斜面穿刺会断层，这是为什么？
答：产气菌产气使培养基断层，或培养基本身质量问题。
9.第一代菌种可不可以作为工作菌株使用？
答：我们不这样使用，因为担心菌株没有充分复壮，生化特性可能不典型。
10.制备菌悬液时，要使其在10~100cfu中，应多注意的地方是什么？
答：制定标准化操作规程，减少不同实验者带来的误差，接种量、培养温度和时间应每次一致。
11.铜绿假单胞菌不宜放冰箱内保管，但其营养肉汤液能否放在冰箱保管？
答：详见《中国药品检验标准操作规范》2010版341页。能否放冰箱可自行验证。
12.黑曲霉的存放期如何验证？
答：通过孢子悬液计数和菌落特征，进行验证。
13.标准储备菌株必须进行纯度和特性确认？还是在必要情况下才做？
答：详见《中国药品检验标准操作规范》2010版341页，我们在制备标准贮备菌液前进行纯度和特性确认，最好在使用前再进行纯度和特性确认。
14.铜绿假单胞菌贮存温度应为多少度？
答：一般在10℃以上，甘油冻存管至少在-30℃以下。
15.制备工作菌种进行菌种保藏中的保存期是否要进行验证？
答：可参考2010年版《中国药典》标准操作规程（SOP），应进行验证。
16.验证用菌株可否使用ATCC？
答：如果按中国药典检验的，用CMCC
17.菌种鉴定该如何做？
答：请参考讲义内容。
18.药典菌悬液制备是要菌种的新鲜培养物接种至培养基中，培养18-24h再进行稀释，制备菌悬液，可否直接使用未过期工作菌种进行稀释来制备菌悬液？
答：按药典要求不行，如要使用，请自己验证。。
19.斜面低温保藏法：每一次的菌种传代都需要做菌种纯度鉴定吗？
答：建议制备斜面保存管前进行菌种纯度鉴定，以后的每次传代视具体情况而定。
20.如何比较快速有效判断菌液的浓度？除了可以用“比浊仪”参考，还有什么方法？
答：比浊仪只做辅助参考，还需通过平板计数来最后确认菌液的浓度。
21.曾于中检所中购买过黑曲霉的0代包子悬液，说明书上表示应于-20&--#8451;中保存，可保存一年，对于此保存唯独及效期，药企可否同法保存自制的黑曲霉孢子悬液？是否要验证？如何验证？
答：黑曲霉孢子悬液制备请参照2010版药典的相关内容。关于验证在前面的问题中已经回复。
22.菌种纯度确认，怎么确认，需确认哪些项目？
答：请参照2010版药典的相关内容。
23.细菌菌种接入营养肉汤中保存一周，这需要验证吗？、
答：建议做验证。
24.菌种斜面最多能保存菌几代？经冰箱保存的斜面菌种是否需复苏二次才能进行菌悬液配制？
答：药典规定，菌种传代不应超过5代。冰箱保存的斜面菌种复苏后即可使用。
25.革兰氏染色的时间一般多长时间，染色时间长了对结果有无影响？
答：详见讲义内容，应严格控制染色时间，否则对结果影响很大。
26.哥伦比亚血琼脂平皿生长的菌落，对氧化酶试验是否有影响？菌悬液的制备过程中，接种菌种新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，这个新鲜培养物怎么理解，冰箱保存斜面菌种是新鲜培养物吗？
答：没使用过哥伦比亚血琼脂及相关实验。新鲜培养物指刚培养好的菌株，冰箱保存斜面菌种不算新鲜培养物。
27.菌种鉴定时，一定要根据药典的所有试验做完，才能确认是某种菌株吗？可否省略一些试验？
答：请按药典规定来进行菌种鉴定，具体情况可能还要增加适宜的鉴定试验。
28.工作菌株可在25℃连续使用一周，是指同一代同一管的菌株吗？还是说同一代不同管的菌株？
答：笔误更正，同上一题。
29.若没有比浊仪，用什么方法来确认50~100cfu/ml？特别是孢子？
答：孢子计数建议通过平板计数的方法来确定浓度。
30.工作菌种是否可以使用后再次冷藏使用（斜面保藏法）？
答：请自行掌握。
31.大肠埃希菌镜检时，有时固定好的菌在染色过程中脱落，请问是什么原因引起这种情况？
答：首先，洗干净拨片，挑菌注意不要太多，待菌固定好后再进行染色。
32.生孢梭菌，菌落培养计数时一定要在厌氧条件下进行吗？
答：是
33.菌悬液怎样在24h内确定其菌落数？请讲解细菌和真菌的方法.
答：平板计数方法。
34.生孢梭菌培养时，怎样做才能使其在厌氧中培养？
答：详见2010版药典
35.菌种的纯度鉴定包括哪些内容？如果是跟省药检所买的3代菌是否就不用做纯度或确认试验？
答：省所现在销售的是第二代的甘油冷冻管，严格来说，请做纯度确认。
36.为什么有时候细菌管会长真菌，而真菌管也会长细菌。
答：原因可能是多方面的，某些细菌适宜在真菌培养基上生长，而某些真菌也能在细菌培养基上生长。比如2010版药典无菌检查法，两种培养基的使用范围已删去，已不是绝对的细菌培养基或真菌培养基。
37.在做方法验证时，黑曲霉菌浓度大于20cfu/皿时，培养5天后菌落蔓延扩散，无法各个区分，如何在药典要求的50~100cfu和实际操作结果中找到平衡？因为菌浓对回收率及操作RSD%影响很多.
答：培养48-72h后，菌落刚形成时，及时点计并做记号，然后每天观察有无新的菌落长出并计数。
38.标准菌黑曲霉在传代前需要先接到改良马丁培养基复苏后，再传代，如果需要，接到改良马丁培养基后培养时间怎么定？
答：2010版药典规定 ，黑曲霉传代，培养时间为5~7天
39.有时候在玫瑰红钠琼脂或营养琼脂平板上生长有酵母菌，在酵母菌生长的位置底部产生了一个气泡状的圆形，把底部的琼脂都贡起来了，又或者表面没有任何菌落，而琼脂被贡起来，请问这种圆形气泡是菌吗？在计数时是否也把它算入酵母菌？
答：建议挑取气泡内含物接种至改良马丁琼脂培养基中，若能生长，且为酵母菌的菌落形态，应该可以将其算入酵母菌。
40.大肠生化实验中的靛基质试验（I）项结果为“ ”或者“-”均不影响最终结果的判断，请问该项的意义何在？是否可以取消？
答：反应为 ，为典型大肠埃希氏菌，-为非典型大肠埃希菌。关系到最终判断，都是必须的实验，不可取消。
41.生化检查用的鉴定盒是否需要跟培养基一样做适用性检查？如果需要做，应该如何进行？
答：用阳性菌做一次，实验结果相符即可。
42.铜绿假单胞菌用什么方法保存及更活处理方法？
答：建议采用甘油冻存管（终浓度为20%的甘油冻存管），-30℃（或更低温度）保存。
43.工作菌种每代可保存多长时间（斜面低温保藏法）才传下一代？
答：教科书上的保存时间为1-6个月。
44.工作菌株的使用记录（时间、用途、使用者等）是否需要建立台账？
答：是
45.菌株的纯度和特性要多久确认一次，最短时间和最长时间分别是多少？
答：做标准储备菌株之前务必要进行鉴定，其它根据实际情况：如污染、活性下降、储存条件发上改变等。
46.革兰氏染色前，菌落是否要先纯化（接到营养琼脂斜面上）还是直接从选择性培养基上挑起菌落直接染色？
答：要纯化，从选择性培养基挑取单个菌落，最好先接到营养琼脂斜面后，再进行染色。
47.真菌接至改良马丁液体培养基中，培养时间为多长？（白色念珠菌、黑曲霉）答：见2010版药典。
48.菌种鉴定一定要做到生化鉴定吗？
答：要。可以选择传统的生化试验鉴定，也可选择鉴定仪或鉴定试剂条。请视自身情况而定。
49.是否可按10版药典中抑制控制菌检验判定方法进行？比如金葡菌做甘露醇平板分离，革兰染色，血浆凝固酶为阳性就可以了。
答：金葡这样做可以。其他菌株视具体情况而选择适宜的鉴定试验。
50.请介绍一下，有什么简便的方法灭菌甘油？
答：高压湿热灭菌法
51.黑曲霉孢子悬液贮存期验证怎么做。‘
答：请参考前面该问题的答复。
52.铜绿假单胞菌琼脂斜面变红，是否会造成菌种变异？如何避免该情况出现？（本菌株于25℃保存）
答：出现这样的情况建议对菌种纯度进行鉴定。实验操作请注意防止污染。
53.铜绿假单胞菌菌悬液是否也可在2~8℃保存，24小时内使用？
答：不建议，请自己验证。
54.是否一定要使用CMCC的菌株吗？
答：药典是这样规定的。
55.假如使用ATCC的菌株代替CMCC的可以吗？
答：请按药典规定来进行实验，若是药品检验，请用CMCC菌株。
56.可以用液氮保藏甘油冷冻管吗？可以的话应该怎么操作？
答：可以。具体操作不清楚。我们没有液氮保存罐。
57.贵所有开展支原体检查法这个实验吗？
答：没有
58.制备菌悬液的时候，培养物用的营养肉汤用量是多少？
答：没有具体规定，请自行制定。
59.制备菌悬液的时候怎样保证他是50cfu呢？具体说一下操作方法
答：自行摸索一套方法，固定下来，以后就按该方法做就可以了。
60.请问菌种斜面最好多长时间转接一次？
答：参考上一题。
61.20%甘油v∕v是用水还是用相应培养基做稀释？
答：用相应的培养基。
62.验证或做培养基的适用性检查时，若实际操作制得的菌悬液，经测定计数后不在规定的范围内，如＞100cfu，是否应判本次实验无效，应重试？若试菌，真菌生长较慢，不能短期内预算菌数，如何解决？
答：第一个问题，请重试。第二个问题，请注意积累平时实验经验，标准化操作，慢慢摸索稀释的倍数。
63.有时候酵母菌在玫瑰红钠平板上不易观察，是否可用孟加拉琼脂培养基代替来作培养？
答：药品检验请严格按药典规定，若是平时科研，应该可以用孟加拉红琼脂培养基代替。
64.菌种的每一次传代（如3代→4代→5代）都必须做菌种鉴定实验吗？
答：视具体情况而定。
65.如何控制菌液的浓度为50～100cfu/ml？
答：见前面问题的回复。
66.菌种的传代，营养肉汤或改良马丁0.5ml～0.8ml复苏冻干菌粉→直接涂布于营养琼脂培养基或改良马丁琼脂培养箱→是第一代还是第二代？
答：冻干菌粉为第0代，若冻干菌粉未经过培养，直接涂布到培养基上，为第1代。
67.请教一个有关微生物限度检查的问题，在制备10～100cfu菌液时除了你说的比浊法，比较普遍的就是平板计数法，而其中用到的六种试验菌，细菌用营养琼脂计数，霉菌用玫瑰红钠琼脂平板计数，其它四种菌应用何种培养基计数？
答：不知道此处所说的其他4种指的是什么菌。
68.只用平板计数，结果准确吗？还有没有其他方法制备10～100cfu菌悬液？答：这是一个很好的课题，若感兴趣，你们可以好好研究一下。
69.大肠埃希菌检查中，MUG培养基配制后显荧光是什么原因？
答：有可能试管玻璃材质自发荧光，也可能清洗不干净，或培养基本身质量，比如有无发生污染等。
70.请问可用何种培养基或手段鉴定枯草芽孢杆菌？eg：大肠埃希菌用EMB，金黄色葡萄球菌用甘露醇
答：目前尚未有合适的选择性培养来鉴定枯草芽孢杆菌，可选用API 或细菌鉴定仪等手段来鉴定。
71.请问：细菌鉴定仪有哪些用途？能够鉴定沙门菌属下的各种沙门菌么？怎样应用？
答：如有需要，可联系梅里埃的技术支持人员：13503006367 霍工。他会详细解答你想问的问题。
72.黑曲霉菌在2~8℃保存经验证后能否延长使用时间？
答：药典规定在验证过的期限内使用。
73菌种的保藏可否用液体石蜡保藏？与甘油冷冻保藏有何区别？
答：药典未记载液体石蜡保藏法，部分参考书记载斜面保藏法或半固定保藏法可加灭菌石蜡覆盖。
