爱华网1 疫苗的研究阶段 疫苗的发展过程分为基础研究阶段 (包括病理学 、微生物学等) 、免疫机理研究 、临床前期试验 、临床试验(包括I 期临床试验 、II 期临床试验 、III期临床试验) 、样品的大量生产以及最后的产品注册六个阶段 。基础研究阶段主要是筛选保护性抗原和确定抗感染保护性免疫的机理(是以细胞免疫还是以体液免疫为主) 。临床前期试验主要是指在实验室内所进行的免疫及免疫保护性试验。所用的免疫原也多为“实验室产品”。I 期临床试验是对GMP(Good Manufact uringPractice ,国内译称《药品生产质量管理规范》) 产品的安全性进行正规的免疫程序后的观察。其关键指标 (即就是免疫后该产品 (免疫原和佐剂) 是否对免疫的个体(动物或人) 产生明显的局部或全身性的不良反应 。I期临床试验还可分为 Ia 和 Ib 两个过程 , Ia 为对疫区外的个体 (人或动物) 的免疫安全性试验 ; Ib为对生活在疫区内的个体的免疫安全性试验 。II 期临床试验是对疫苗的免疫保护作用的初步检测 ,分为IIa 和 IIb 两个阶段 。IIa 多在疫区外进行,所测试的样本 (即免疫的个体) 量一般不很大 。试验的指标包括免疫群体对疫苗的免疫应答反应和抵抗病原攻击(Challenge)的免疫保护效果 。IIb 是在 IIa 的基础上 ,在疫区内重复 IIa 的免疫试验。在取得良好的IIb 效果的基础上 ,对疫苗的试验可以进入III 期临床阶段 。III 期试验是对疫苗的保护性效果的最后测试。所用的样本量远多于I 期和II 期临床试验阶段,其检测指标以保护效果为主 。如果 II 期和 III 期试验的结果比较稳定 ,安全性和保护性都达到了预期目标,便可以申请产品注册和临床使用 。一个疫苗从开始研究到最后形成产品大约需要 10 至 15 年的时间 。
2 疫苗的研制方法和种类
疫苗的研制方法主要有传统方法和现代生物学技术方法两种 ,其中传统方法包括分离自然毒株或弱毒株、经连续细胞培养和传代使病原体发生遗传变异并导致毒力减弱 、用化学或物理方法将病原体致弱或灭活并提取病原体的有效成分等,而现代生物学技术主要是以现代分子生物学技术方法制备疫苗 。传统方法利用病原生物的原始抗原制备疫苗 ,其制备方法简单、保护作用强且有效周期长 。但是疫苗的产量却完全依赖于病原体体外培养及其获得量的多少 。现代生物学技术方法虽然可以解决抗原生产的问题,但单一抗原的免疫原性往往低于复合抗原 ,而且还存在交叉免疫保护性差及佐剂不强等问题 。从目前所使用的疫苗种类来看,绝大多数疫苗还是以传统方法制备为主 。疫苗的种类主要有 :1.弱毒苗 。2. 灭活苗 。3. 有效成分苗 。4. 亚单位苗(包括体外表达的蛋白质疫苗) 。5. 核酸苗 ( 包括 重组 质 粒 、RNA 和cDNA 表达文库苗) 。6. 重 组 病毒疫 苗(重 组 病 毒 载体 疫苗) 。7. 合成肽苗 。8. 重组活菌苗 。自 20 世纪 90 年代初以来,不论是研究单位还是药物开发企业都在基因工程疫苗方面进行了大量的投入,但到目前为止投放到市场上的产品还只有重组蛋白质疫苗和一些兽用重组病毒疫苗 ,其它的基因工程疫苗还多处在研发状态。但随着疫苗研制技术的不断进步 ,今后基因重组疫苗的应用会愈来愈多 。
3 基因工程疫苗
3. 1 亚单位疫苗或基因工程蛋白质疫苗 此类疫苗是利用基因工程的方法将病原微生物的主要免疫原在异源宿主细胞内表达后制备而成。值得一提的是 ,寄生虫学家 Dr OdilePuijalo n 于 20 世纪 70年代在世界上率先进行了大肠杆菌表达外源基因的试验 ,从此揭开了以基因重组方法表达和制备蛋白质的序幕 。世界上第一个基因重组蛋白质疫苗-乙肝表面抗原疫苗从 20 世纪 80 年代开始使用以来,在乙肝的免疫预防方面发挥着重要的作用 。到目前为止 ,亚单位疫苗或基因工程蛋白质疫苗仍然是疫苗发展的主要方向 ,主要原因在于 :A.大规模生产蛋白质的生物反应器 (如大肠杆菌、蚕细胞和酵母细胞等) 、生产工艺 (包括蛋白质提纯技术)都很成熟〔3〕。B.安全性可靠。绝大多数蛋白质对机体不存在感染和其它致病作用 。安全性明显高于弱毒疫苗和 DNA 重组质粒疫苗 。
基因工程蛋白质生产的生物反应器主要有细菌 、蚕细胞及酵母菌细胞(毕氏酵母菌Pichi a p astoris 和酿酒酵母菌Saccha rom yces cerevisi ae) 和其它真核细胞 。这几种生物反应器各有其优点和局限性。细菌尤其是大肠杆菌的培养方法最简单 ,需要的试验条件最少 ,几乎在任何具备摇床和培养瓶的实验室都可以进行重组蛋白质表达的试验。但是大肠杆菌表达重组蛋白质主要存在以下几个问题 :1) 重组蛋白质的分子结构与原始蛋白质的结构存在差异。虽然用于大肠杆菌的表达质粒很多 ,但目前大肠杆菌表达质粒的启动子多采用 l ac、t r p 、pl、recA和 t ac , T7等几种〔3〕。这些启动子都是较强的启动子 ,因而蛋白质表达的过程多为“高效表达”。但是大量的重组蛋白质在胞浆内表达后,由于细胞浆的还原环境及缺少足够的折叠辅助蛋白质 (如 chap ro ne) ,往往造成表达后的处理 (尤其是二硫键的形成)过程无法完成 ,导致大量半折叠或没有形成最终结构的多肽在胞浆内集聚 ,进而形成包涵体。尽管有些蛋白质经包涵体提纯后仍可再复性形成正确的结构 ,但很多蛋白质不能回复到原始结构 。因而,应该避免用大肠杆菌表达含有过多疏水氨基酸和半胱氨酸的蛋白质 (如膜蛋白) 。为了减缓“高效表达”过程 ,可降低培养的温度,因为处于对数生长期 (log p hase) 的大肠杆菌在 37 ℃的环境中每隔 20min 就分裂 1 次 ,而在 16～20℃环境状态下其繁殖速度就很慢 ,主要是由于细菌内的各种蛋白质的合成过程都变得比较缓慢 ,蛋白质产量虽然降低了,但所表达的蛋白质多成可溶性状态 。这种方法需要可调控温度的特殊培养装置如低温摇床或可控制温度的培养发酵罐 ( Fermento r)。减缓“高效表达”的另一个方法是在培养基内的细菌达到对数生长期后再启动表达过程 。随着培养基中营养成分的减少和代谢物的增加,处于对数生长后期的细菌的繁殖过程和细胞内的蛋白质合成速度都减慢 ,这时启动表达过程 (如在培养基中加入 IP T G)有利于对表达后蛋白质的折叠处理〔4〕。该方法的一个缺点是培养基中的有些氨基酸的含量可能很低 ,氨基酸缺乏往往是造成核糖体提前从mRNA模板上脱离下来的一个主要原因 ,从而导致所提纯的重组蛋白质的分子量大小不一 (经 SDS2PA GE 分析发现有很多的条带) 。2)有些异源蛋白质对大肠杆菌还有毒害作用“高效表达”,后会导致细菌过早停止繁殖甚至死亡。目前还没有办法解决这个难题 ,尽管革兰氏阴性菌 (大肠杆菌) 可以将表达的蛋白质输送到细胞膜和细胞壁之间,但重组蛋白质仍不能被分泌到细胞外 。3) 很多生物的密码子序列组成与细菌的密码子存在差异。各种生物体在进化过程中都形成了各自的密码子序列的特征 。编码同一氨基酸的密码子在不同物种间可能有所区别〔5〕。另外一些生物的 DNA序列富含 C/ G 碱基 (如弓形虫) 或 A/ T 碱基 (如恶性疟原虫) ,大肠杆菌的基因组序列中四种碱基的组成却趋于平衡 。因而,在将目的基因克隆到表达载体之前需要对该基因序列进行优化 ( Sequence optimization),使该序列更接近大肠杆菌的密码子组成〔6〕。4)大肠杆菌表达的重组蛋白质不能用于检测T 细胞免疫应答反应。这主要是由于 T 细胞对重组蛋白质中的非特异成分 (如来自大肠杆菌等的 L PS 和细菌本身的蛋白质) 非常敏感。这是目前检测T 细胞免疫应答反应都使用合成肽的原因之一。
除了大肠杆菌表达系统外 ,目前重组蛋白质表达系统还有乳酸菌 ( l actococcus bacteri a)、酵母细胞和蚕细胞等〔3 ,7 8〕。乳酸菌表达系统的优点是蛋白质表达过程可通过 p H 调节 ,不再需要向培养基中加入类似 IP TG 的诱导物 ,既简化了操作程序又降低了成本 。此外 ,乳酸菌的一个重要特点是可以将重组蛋白质分泌到细胞外 (即细菌培养基内),因而非常适合于表达对大肠杆菌有毒性作用的蛋白质 。一般情况下 ,凡是能被分泌到细胞外的蛋白质都具有正确的分子结构 。此外,大肠杆菌和乳酸菌的一个共同优点是这些细菌都没有对表达的蛋白质进行糖基化的反应系统 。因而 ,所表达的蛋白质没有任何化学修饰,便于对重组蛋白质进行结构和功能的分析 。
蚕细胞和酵母细胞是目前应用最为广泛的真核细胞表达系统〔7 8〕。由于这些细胞具备完整的蛋白质组装和修饰系统,所表达的重组蛋白质的结构多接近于原始蛋白质 。此外 ,对这两种细胞进行悬浮高密度培养 ,其蛋白质的产量和纯度均高于大肠杆菌表达方法。用于人的蛋白质疫苗多由这两种细胞表达的蛋白质制备而成 。但是 ,由于这两种细胞都具备完整的表达后修饰过程,因而再进行基因克隆时必须
先将所要表达的蛋白质序列中的糖基化位点突变成非糖基化位点 。
总之 ,不论原核生物表达系统还是真核生物表达系统 ,只有重组蛋白质的结构与原始蛋白质的结构一致时,其所引起的免疫学反应才能对病原发挥免疫抑制作用 。此外 ,外源性抗原 (如蛋白质类疫苗) 在机体内主要是通过 M HC II途径递呈给免疫应答系统的 ,所激发的免疫应答多趋向于体液免疫应答 ,而且需要很强的免疫佐剂 。
3. 2 DNA 质粒型疫苗 人们在发现直接注射含有抗原基因的DNA 表达质粒也能获得特异性的抗感染免疫后〔8〕,各种DNA疫苗和虫苗的研究快速发展起来,且在以小鼠为模型的免疫及功能试验中都取得了令人振奋的保护效果。很多人认为,DNA疫苗可以解决疫苗研究过程中存在的很多问题,如免疫原性低,疫苗成分稳定性差,需要冷藏保存环境及成本过高等〔9210〕。然而,经过近20多年来的探索,人们逐渐认识到DNA 质粒疫苗的免疫原性还远不如蛋白质和重组病毒疫苗。其中的一个关键技术问题是纯净的DNA分子不能主动进入细胞,而且质粒DNA 必须从细胞浆传输到细胞核内才能被转录成mRNA,进而进行表达。因为在正常的高等生物的生命活动过程中并不存在质粒DNA 的主动传输过程。目前DNA 质粒疫苗具有用量大(多在毫克水平)、表达时间短及免疫原性低等特点〔11〕。尽管人们对DNA 疫苗免疫原性的研究还在进行大量的投入,在取得关键性技术突破之前,DNA质粒型疫苗(包括虫苗) 还不能取代蛋白质和重组病毒类疫苗。目前提高DNA 质粒疫苗的免疫原性的尝试有〔12〕:1)在编码抗原基因的上游插入可复制mRNA 的RNA 复制酶,以增加mRNA 和蛋白质的转录及其表达量。目前的DNA 质粒疫苗多采用CMV启动子,尽管该启动子具有很弱的种属特异性,但有人认为CMV(cytomega virus) 易引起转化细胞过早地产生干扰素(Inter2feron , IFN) 和肿瘤坏死因子( Tumor necrosis factor ,TNF)应答反应,进而导致细胞的凋亡。为了解决这一问题,可用非病毒性启动子取代CMV 启动子,同时在抗原基因的上游插入一个编码RNA复制酶(RNA replicase) 的基因。RNA复制酶可在细胞浆内将编码抗原的mRNA 复制100万倍以上,进而增加了目的抗原的表达量〔13〕。2) 在抗原基因的下游插入编码细胞因子(如IL1 、IL12 、GM2CSF 等)的基因〔14〕。通过细胞因子的非特异性免疫激活作用增强机体的应答反应。3) 增强细胞转染效率:将DNA与脂类化合物混合制成脂质体及用基因枪的方法取代常规注射的方法〔15〕。4) 以Prime2boost法加强体液或细胞免疫应答反应〔16217〕。由于外源基因是在免疫的动物或人体内表达后再递呈给免疫系统的,所以抗原决定簇既可以通过MHCI 途径,又可以通过MHC II 途径递呈给免疫系统。但大量的免疫试验证实DNA 类疫苗多以激发机体产生T细胞介导的细胞免疫应答为主。但是也可以根据需要,通过不同的加强免疫方式引导机体以体液免疫或细胞免疫为主。例如,用重组DNA质粒作初始免疫原,再用含有相同基因的重组痘病毒(vaccini2a)加强免疫,所获得的免疫应答反应主要是细胞免疫应答。要达到体液免疫为主的目的,可先用重组DNA质粒或重组病毒作为初始免疫原,再用蛋白质抗原加强免疫〔17〕。5) 改变质粒DNA 的非编码区,增加有利于体液或细胞免疫应答反应的CpG决定簇〔18〕。Cp G决定簇主要是指在细菌DNA中那些没有甲基化的CpG序列,高等生物在进化过程中形成了识别这些序列的先天性免疫反应系统(主要通过与Toll2like receptor 9 结合)。非甲基化的Cp G可激发免疫系统(单核细胞、树突状细胞) 分泌有利于体液或细胞免疫反应的细胞因子。根据序列组成的不同,有些CpG决定簇以激发体液免疫应答反应为主,有些Cp G决定簇以激发细胞免疫应答反应为主。此外,不同种动物识别的CpG决定簇的序列也有所差异,如对小鼠有很强作用的Cp G决定簇对人和其它高等哺乳动物的免疫刺激却很弱。因而,不同种类的动物可能需要设计不同的Cp G决定簇作为免疫增强剂。3. 3 重组病毒型疫苗 以病毒作为载体制备活载体疫苗是当前疫苗研究的另一主流发展趋势。这主要是因为:A.病毒是生命进化过程中的最初等生物之一,高等生物体内具有识别病毒成分(蛋白质和核酸)的完整的先天免疫机制。很多病毒的结构蛋白质成分就是很好的免疫增强佐剂,因而对病毒的免疫应答反应往往迅速有效。B.病毒可主动将基因(包括RNA) 传输到细胞内,因而不存在DNA质粒疫苗的细胞膜屏障问题。外源基因在细胞内的表达量往往是DNA质粒的数万倍。抗疟疾和HIV 的重组痘病毒和腺病毒疫苗都已进入了I期和II 期临床试验。
3. 3. 1 重组DNA 病毒疫苗 重组DNA病毒疫苗主要是将抗原基因克隆到经过遗传学修饰的痘病毒和腺病毒载体上而制备的重组DNA病毒疫苗〔19221〕。由于痘病毒在消灭天花病毒的免疫预防过程中发挥了决定性〔2〕和高效的免疫激活作用,人们随后开始利用痘病毒作为载体进行其它传染病的预防。痘病毒的基因组在180kb以上,编码200多个功能蛋白质。在将一种痘病毒作为载体制备重组病毒之前,首先需要将病毒基因组内的与毒力有关的基因剔除。在分子生物学方法诞生之前,人们主要是通过反复的细胞传代的方法使病毒丢失一些基因。如今可以采用基因敲除的方法将一些基因定点敲除。一般认为痘苗病毒有18个与其致病力有关的基因。 由于痘病毒的基因组较大,重组病毒可容纳单一或多个外源抗原基因。外源基因的克隆都是通过基因重组的方式进行的,即将含有外源基因的质粒转染痘病毒感染的细胞,再通过缺失选择(Negativeselection)的方法,筛选重组病毒。作为疫苗载体,痘病毒具有两个缺点,一是病毒的结构复杂,接种后必然刺激机体产生非相关性抗病毒免疫反应,从而稀释了特异性的免疫反应。二是不能保证重组病毒的安全性。因而,重组病毒疫苗对有些个体(如HIV感染者) 并不一定很安全。目前比较常用的MVA 病毒(Modified vaccina vi2rus Ankara)是毒力最弱的一种疫苗载体,此外还有N YVAC(New York vaccinia)。为进一步避免交叉免疫反应,还有人采用动物病毒(如禽病毒Fowlpox virus)作为人用疫苗的载体。目前由重组痘病毒作为载体进行的疫苗试验的有很多种,其中包括狂犬病疫苗、HIV疫苗、疟疾疫苗、结核病疫苗等。 重组腺病毒是最先被用来作为基因治疗的载体,由于各种原因,以腺病毒作为载体在基因治疗方面一直没有取得重要突破。该种病毒具有感染分裂和非分裂细胞的特性,更适合作为疫苗的载体。腺病毒共用50多个血清型,基因组在34～43kb 之间。目前应用较多的疫苗载体多是将E1 基因删除的变异型。重组的病毒载体可容纳1. 8～3.5kb的外源基因。重组腺病毒载体的一个最大缺点是自然存在的抗病毒免疫,尤其是机体内的抗腺病毒中和抗体,是抑制疫苗发挥作用的重要因素。 除了上述痘病毒和腺病毒载体疫苗以外,目前 作为疫苗载体的病毒还有弱毒麻疹病毒、痘苗病毒(如前述MVA和N YVAC) 、弱毒流感病毒及黄热病病毒等。这些病毒的免疫原性很高,多可达到“一针见效”的免疫效果,且生产上具有成熟的GMP设备,相信未来有愈来愈多重组疫苗会选择这些病毒作为载体。3. 3. 2 重组RNA 病毒型疫苗 与重组DNA病毒疫苗相比,尽管以SFV 和VSV 为代表的重组RNA 疫苗的免疫保护效果非常可观(如抗Ebola 和Marbo 病毒疫苗等),但还停留在动物模型的试验阶段。SFV 疫苗载体是根据从非洲乌干达分离到的Semliki 森林病毒(Semliki forestvirus ,SFV)改造而成。SFV 病毒是一种正链RNA 病毒,其基因组只有12kb (图1) ,编码RNA 复制酶(RNAreplicase) 和病毒结构基因(主要编码病毒表面的棘蛋白和膜蛋白)。由于该病毒基因组结构简单,因而很容易将外源基因克隆到病毒基因组内。SFV重组疫苗的制备方法〔22〕是将抗原基因完全取代病毒的结构基因,再将病毒的两个结构基因分别克隆到另外两个表达载体上。将上述三个重组质粒同时转染真核细胞,三个质粒在细胞内同时转录并表达。由于RNA复制酶的活性,使转录的三种RNA 在细胞内大量扩增并表达。表达的两个结构蛋白质能识别含有RNA 复制酶和抗原基因的mRNA,并将其包装成只含有该mRNA 的假病毒颗粒。用这种假病毒颗粒免疫后,使编码抗原的mRNA在细胞内大量复制并表达,但不能再包装成新的表达颗粒。因而该系统的生物安全性高于其它DNA疫苗系统。此外,由于RNA复制酶和大量抗原的表达,细胞的其它自身蛋白质合成系统都被关闭,在抗原被表达20 h以后,被感染的细胞开始进入细胞凋亡的过程(这是SFV 疫苗被称作自杀疫苗的主要原因)。抗原合成细胞凋亡后很快被巨噬细胞吞噬,因而非常有利于将抗原决定簇递呈给免疫系统〔23〕。 根据水泡性口炎病毒(Vesicularstomatitis virus ,VSV)构建的重组疫苗载体在很多传染病的免疫试验中都取得了较SFV 系统更好的效果。VSV是弹状病毒属的一种RNA病毒,其基因组含有一条11kb 的负链RNA〔24〕,编码四种内部结构蛋白,包括核蛋白(N) 、磷酸蛋白(P) 、基质蛋白(M)和病毒聚合酶(L) 。 此外,还编码一种跨膜糖蛋白(G)〔24〕。重组的病毒载体是在病毒结构基因的上游插入T7 噬菌体启动子,可将抗原将噬菌体T7启动子插入在病毒机构基因的上游。将抗原基因克隆在病毒膜蛋白基因( G) 和聚合酶(L) 基因之间(A)。重组抗原在病毒的表面( 表达。
但这两类疫苗在短期内还不能在人体上进行免疫试验,主要是因为SFV 疫苗的GMP 生产系统还没有解决, 而VSV疫苗在人体上的安全性还是人们关注的重要因素。重组基因工程病毒疫苗的一个主要技术问题是如何避开先天或后天的抗病毒免疫。3. 4 重组活细菌类疫苗(Live bacterial vaccines)早在1884年人类就尝试了用弱毒伤寒菌免疫的可行性。起初的活菌疫苗如BCG和弱毒伤寒菌疫苗都是利用弱毒活菌免疫后产生对该病原菌的特异性免疫反应。近年来,随着分子生物学技术的不断成熟,人们开始利用弱毒菌或无毒菌作为载体(vaccinevehicle) 制备多价免疫或治疗性疫苗〔26227〕。目前用于研制活菌疫苗的细菌主要有两类:一类是弱毒菌,主要有牛结核杆菌BCG(Mycobacteri um bovis B CG) 、减毒沙门氏杆菌( S almonel la t y phimuri um)、减毒单核细胞李氏杆菌(L isteria monocy togenes) 、减毒霍乱弧菌(V ibrio cholerae)和减毒志贺氏菌( S hi gel la f lex neri)等。利用这些弱毒或减毒菌所制备的疫苗具有很多的优越性:首先,活菌免疫多经口腔、鼻腔或其它粘膜途径接种,免疫的途径更接近于自然感染过程,在操作上较其它种疫苗更容易进行。其次,在免疫过程中不需要非常专业的技术人员,操作程序简单而经济;缺点是有些弱毒菌有可能重新恢复毒力。此外,这类疫苗不适于对免疫功能低下的人群(如艾滋病患者、器官移植病人和接受放疗或化疗的病人)使用〔26〕。第二类是食用菌类〔1〕,主要有乳酸球菌( L actococcus lact is) 、芽胚乳酸杆菌( Lacto2baci l l us plantarum) 和高氏链球菌( S t reptococcus gordoni i)等。这类细菌的优点是对人和动物没有任何危害,多年来一直用于制备各种食品(如奶酪等)。此外,这些细菌具有完整的分泌系统,可以将所表达的蛋白质分泌到细胞外,因而可以将这类细菌开发成预防和治疗兼备的生物反应器,如将具有分泌单链抗体功能的细菌接种到肠道或生殖道,可以达到治疗和预防特殊疾病感染的目的〔28〕。这类疫苗的缺点是免疫原性较低,主要是由于食源性细菌的抗原递呈功能较弱。口服用疫苗的另外一个缺点是重组细菌可能会不断的经消化道排放到自然环境。可导致自然环境中的基因(耐药基因和抗原基因)的污染。这也是目前还没有一种活菌疫苗被正式批准使用的一个主要原因。随着分子生物学技术的不断完善,制备出不具有耐药性基因甚至在离开机体就失去活力的重组细菌必将使这个问题得以解决。 综上所述,基因工程重组疫苗作为现代分子生物学和分子免疫学的一个主要发展方向,在各种疾病的免疫预防方面发挥越来越大的作用。虽然抗寄生虫虫苗的发展速度还落后于细菌和病毒疫苗的发展速度,但随着各种寄生虫基因组序列的测定以及新的免疫技术的不断出现,相信会研制出更多的抗寄生虫虫苗并在控制危害较为严重的寄生虫病(如疟疾、血吸虫病等)方面发挥重大的作用。
