| 第二课 蛋白质组学研究 一、酵母双杂交技术及其在蛋白质组研究中的应用
杨齐衡 李 林*
(中国科学院上海生物化学研究所, 上海200031) 作为后基因组时代出现的新兴研究领域之一,蛋白质组学(proteomics)正受到越来越多的关注。蛋白质组学的研究目标是对机体或细胞的所有蛋白质进行鉴定和结构功能分析。蛋白质组学的研究不局限任何特定的方法。高分辨率的蛋白质分离技术如二维凝胶电泳和高效液相层析,经典的蛋白质鉴定方法如氨基酸序列分析等,现代质谱技术, 基因组学研究的各种手段,现代计算机信息学和计算机网络通讯技术等等,任何可用于蛋白质研究的技术手段,蛋白质组学都可能会采用。它体现的是一个开放的思维和研究方式。
蛋白质-蛋白质的相互作用是细胞生命活动的基础和特征。这种千变万化的相互作用以及由此形成的纷繁复杂的蛋白质联系网络同样也是蛋白质组学的研究内容,相应的工作也已经开展。
酵母双杂交系统(yeast two-hybridsystem)自建立以来已经成为分析蛋白质相互作用的强有力的方法之一。该方法在不断完善,如今它不但可用来在体内检验蛋白质间的相互作用,而且还能用来发现新的作用蛋白质,在对蛋白质组中特定的代谢途径中蛋白质相互作用关系网络的认识上发挥了重要的作用。实验表明双杂交技术在蛋白质组学上的应用是成功的。本文将就双杂交技术的产生、发展及其在蛋白质组研究方面的初步应用作一介绍。 1 蛋白质组学的产生背景
基因组研究自从开展以来已经取得了举世瞩目的成就。在过去几年中,已经陆续完成了包括大肠杆菌、酿酒酵母等十多种结构比较简单的生物的基因组DNA的全序列分析［1］。线虫(C.elegans)的基因组DNA测序工作已基本完成［2］。规模更为庞大的人类基因组计划预期在下一世纪的前几年(2003～2005年)也将完成全部基因组DNA的序列分析。这些进展是非常令人振奋的。但是也随之产生了新问题。大量涌出的新基因数据迫使我们不得不考虑这些基因编码的蛋白质有什么功能这个问题。不仅如此, 在细胞合成蛋白质之后,这些蛋白质往往还要经历翻译后的加工修饰。也就是说,一个基因对应的不是一种蛋白质而可能是几种甚至是数十种。包容了数千甚至数万种蛋白质的细胞是如何运转的？或者说这些蛋白质在细胞内是怎样工作、如何相互作用、相互协调的？这些问题远不是基因组研究所能回答得了的。正是在此背景下,蛋白质组学(proteomics)应运而生。
蛋白质组(proteome)一词是马克.威尔金斯(MarcWilkins)最先提出来的［3］,最早见诸于1995年7月的“Electrophoresis”杂志上［4］,它是指一个有机体的全部蛋白质组成及其活动方式。蛋白质组研究虽然尚处于初始阶段,但已经取得了一些重要进展。当前蛋白质组学的主要内容是,在建立和发展蛋白质组研究的技术方法的同时,进行蛋白质组分析。对蛋白质组的分析工作大致有两个方面。 一方面,通过二维凝胶电泳得到正常生理条件下的机体、组织或细胞的全部蛋白质的图谱,相关数据将作为待检测机体、组织或细胞的二维参考图谱和数据库。一系列这样的二维参考图谱和数据库已经建立并且可通过联网检索。二维参考图谱建立的意义在于为进一步的分析工作提供基础。蛋白质组分析的另一方面,是比较分析在变化了的生理条件下蛋白质组所发生的变化。如蛋白质表达量的变化, 翻译后修饰的变化,或者可能的条件下分析蛋白质在亚细胞水平上的定位的改变等。关于蛋白质组学的介绍可参阅文献［5,6］。
细胞或组织的蛋白质不是杂乱无章的混合物,蛋白质间的相互作用、相互协调是细胞进行一切代谢活动的基础。蛋白质间的相互作用及作用方式同样也是蛋白质组研究所面临的问题。研究蛋白质间的相互作用有多种方法,常用的如酵母双杂交系统、亲和层析、免疫沉淀、蛋白质交联等。其中,酵母双杂交系统是当前发展迅速、应用广泛的主要方法。 2 酵母双杂交系统的建立与发展
双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明,转录激活因子在结构上是组件式的(modular),即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域(DNA binding domain,简称为DB)和转录激活结构域(activation domain,简称为AD),它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录［7］。
Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立［8］。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型,将前者与Gal4的DB结构域融合,另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(preyor target protein)。 如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用,那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子,从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reportergene)。 通过对报道基因表达产物的检测,反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。在此Fields等人采用编码β-半乳糖苷酶的LacZ作为报道基因,并且在该基因的上游调控区引入受Gal4蛋白调控的GAL1序列。这个改造过的LacZ基因被整合到酵母染色体URA3位上。而酵母的GAL4基因和GAL80基因(Gal80是Gal4的负调控因子)被缺失,从而排除了细胞内源调控因子的影响。已经知道在Snf1和Snf2之间存在相互作用。结果发现只有同时转化了Snf1和Snf2融合表达载体的酵母细胞才有β-半乳糖苷酶活性,单独转化其中任何一个载体都不能检测出β-半乳糖苷酶活性。
目前发展起来的各种双杂交系统大多是以Fields等人建立的系统为基础的。这些新系统主要对报道基因、“诱饵”表达载体以及“猎物”表达载体等做了一些改进。其中一个重要改进是引入额外的报道基因,如广泛采用的HIS3基因。经过改造带有HIS3报道基因的酵母细胞,只有当HIS3被启动表达才能在缺乏组氨酸的选择性培养基上生长。HIS3报道基因的转录表达是由“诱饵”和“猎物”的相互作用所启动的。大多数双杂交系统往往同时使用两个甚至三个报道基因,其中之一是LacZ。这些改造后的基因在启动子区有相同的转录激活因子结合位点,因此可以被相同的转录激活因子(如上述的Gal4蛋白)激活。通过这种双重或多重选择既提高了检测灵敏度又减少了假阳性现象。其他还有针对“诱饵”或“猎物”表达载体等所作的改进,这里不一一详述。
在双杂交鉴定过程中要经过两次转化,这个工作量是相当大的,特别是寻找新的作用蛋白质的时候尤其如此。而且,酵母细胞的转化效率比细菌要低约4个数量级。因此转化步骤就成为双杂交技术的瓶颈。Bendixen等人通过酵母接合型的引用,避免了两次转化操作,同时又提高了双杂交的效率［9］。在酵母的有性生殖过程中涉及到两种配合类型：a接合型和α接合型,这两种单倍体之间接合(mating)能形成二倍体,但a接合型细胞之间或α接合型细胞之间不能接合形成二倍体。根据酵母有性生殖的这一特点,他们将文库质粒转化α接合型酵母细胞,“诱饵”表达载体转化a接合型细胞。然后分别铺筛选平板使细胞长成菌苔(lawn),再将两种菌苔复印到同一个三重筛选平板上,原则上只有诱饵和靶蛋白发生了相互作用的二倍体细胞才能在此平板上生长。单倍体细胞或虽然是二倍体细胞但DB融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。长出来的克隆进一步通过β-半乳糖苷酶活力进行鉴定。这项改进不仅简化了实验操作,而且也提高了双杂交的筛选效率。
在研究蛋白质的结构功能特点、作用方式过程中,有时还要通过突变、加抑制剂等手段破坏蛋白质间的相互作用。针对实际工作中的这种需要,Vidal等人发展了所谓的逆双杂交系统(reverse two-hybridsystem)［10,11］。这项技术的关键是报道基因URA3的引入。URA3基因在这里起到了反选择的作用,它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。该酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)转化成对细胞有毒的物质。Vidal等人通过改造在URA3基因的启动子内引入Gal4的结合位点。这个改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上只有当“诱饵”和“猎物”相互作用激活URA3基因的表达才能生长。在含有5-FOA的完全培养基上“诱饵”和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。然而如果目的蛋白,即与DB或AD融合的蛋白质发生了突变或者由于外加药物的干扰不再相互作用,URA3基因不表达,则细胞能在含有5-FOA的完全培养基上生长。通过这种方法，Vidal等人筛选到了转录因子E2F1的突变物,这些突变物仍然能结合视网膜母细胞瘤蛋白RB,但是丧失了同另外一种称为DP1蛋白的结合能力。结果得到了体外结合实验的验证。通过对这些突变蛋白基因的测序,他们发现了新的E2F1同DP1结合的位点。
以上介绍的酵母双杂交系统都是建立在对RNA聚合酶II的激活的基础上的。这意味着双杂交过程是在细胞核内完成的。然而许多待研究的蛋白质是膜蛋白,它们需定位到膜上之后才能表现正常的生物功能，与其他蛋白质起作用。有些真核细胞蛋白还要经过翻译后的加工修饰如二硫键的形成、糖基化、聚异戊二烯基化等。这些加工修饰在正常的细胞核内不可能发生。有些蛋白质本身具有激活转录的活性,它们可不经过双杂交相互作用即能激活报道基因的表达。因此根据需要有人又发展了新的双杂交系统。例如,Aronheim等人设计了一个Sos蛋白介导的双杂交系统［12］,也被作者称为Sos救活系统(Sos recruitment system)。人的鸟苷酸交换因子-Sos蛋白是一种胞质蛋白,而酵母的鸟苷酸交换因子-cdc25蛋白定位在内膜上,可将相关受体信号传导给Ras蛋白。由cdc25突变产生的一种温度敏感突变型细胞不能在36℃条件下生长。 但是,如果Sos蛋白可以通过某种方式被定位到酵母细胞内膜上,那么它在这种温度敏感突变型细胞中因替代cdc25蛋白的作用,而使酵母恢复在36 ℃条件下生长的能力。在Aronheim等人设计的系统中,待研究的两个蛋白质分别与豆蔻酰基化信号片段和Sos蛋白融合,前一个融合蛋白定位于膜上,如果两个待研究蛋白质之间存在相互作用,这将使Sos也定位到膜上,从而可激活Ras蛋白使酵母在36 ℃下生长。利用该技术Aronheim等人找到了c-Jun的两个新的作用伙伴。
此外还有其他类型的双杂交甚至三杂交系统,本文不再详述。 3 双杂交系统在蛋白质组研究中的应用
双杂交系统在蛋白质组研究上的应用可以说尚处于尝试阶段,这方面的文献报道还很少,但已显示其在分析鉴定细胞内复杂的蛋白质相互作用方面的潜力。这里以两家实验室的工作为例作一介绍。
Fromont-Racine等人［13,14］以10种功能已知的与mRNA前体剪接有关的蛋白质作起始“诱饵”,从含有约5×106个克隆的酿酒酵母基因组文库中进行第一轮筛选(这些基因组DNA与AD的基因融合构成“猎物”表达载体)。经过对阳性克隆“猎物”DNA的序列分析,他们把这些DNA分成两大类共5项(图1)：编码蛋白质的DNA和非编码蛋白质的DNA,前一类分为四项：A1是在序列上彼此有部分重叠的克隆群。这一项也是首先分析考虑的对象；A2和A3分别是靠近ORF起始密码子的编码蛋白质N-末端的片段和ORF内部的大编码片段,A4是其他的编码序列。 这四项优先考虑的顺序是：A1>A2>A3>A4。根据分析把从中得到的4种靶蛋白做成新的“诱饵”进行第二轮筛选。再把从中得到的一种“猎物”做成“诱饵”进行第三轮筛选。如此经过三轮共十五次筛选,他们从中共得到约700个阳性克隆并且对大多数作了部分测序。这些筛选到的靶蛋白中,有9种是已知的mRNA前体剪接因子,5种是新发现的剪接因子,8种是与RNA其他加工过程有关的因子,还有45种与其他的功能有关。另外有9种是转录激活因子,这主要来自假阳性克隆。他们不仅发现了已知剪接因子与其他因子的相互作用,鉴定了一些新的因子,而且建立了这个剪接途径与其他代谢途径的联系。
图1 Fromont-Racine等人的多轮双杂交筛选策略
据此Fromont-Racine等人声称,如果选择不同的细胞代谢或信号转导途径为出发点,通过类似的双杂交实验最终有可能建立酵母细胞完整的蛋白质联系图谱。推而广之,这项技术同样也能用到人类蛋白质组研究中。
Fromont-Racine等人能在较短的时间完成如此大量的筛选、分析工作,一个非常关键的因素是他们采用了上述Bendixen等人建立的通过酵母的有性接合得到双杂交菌株,并且对此技术作了进一步的改进。 Bendixen等人是通过把两种接合型细胞同时复印到一个平板上使之接合；而Fromont-Racine则是把两种细胞直接在滤膜上混合然后铺到选择性平板上,因此避免了烦琐的复印操作,使工作效率进一步有所提高［13］。
与此类似,Hudson等人也正在进行酿酒酵母的蛋白质组的研究分析工作［14］。他们把酵母所有的即约6000多种蛋白质开放读码框(ORF)，分别构建成与DB和AD基因融合的表达载体。两类载体分别转化不同接合型酵母菌株。 6000株分别表达不同的AD-ORF即“猎物”的细胞在16张384孔微滴定板上培养,再取少许菌液点在只表达一种BD融合蛋白的细胞形成的菌苔上使两种细胞接合形成二倍体,然后按照常规的双杂交技术鉴定“诱饵”和AD融合蛋白是否发生相互作用(图2)。整个过程主要是在384孔微滴定板上完成的。和Fromont-Racine等人的方法相比,这个方法的优点是操作过程可最大程度地自动化,微滴定板的使用也大大提高了处理量。这项工作虽已由Frederickson作了介绍,但目前为止尚未见到它正式发表。根据Frederi-ckson的评论, 这个方法如果成功的话,那末它很有可能在人类蛋白质组研究中得到应用。
图2 Hudson等人的微滴定板阵列法策略
4 结束语
酵母双杂交技术问世不到十年,但已经在蛋白质间的相互作用研究、筛选新的蛋白质、研究蛋白质的功能等诸方面发挥重要作用。双杂交技术固然有其内在的不足之处,如通过双杂交观察到的蛋白质的相互作用在真实情况下不一定发生,也即所谓的假阳性；假阴性现象也是双杂交分析过程中经常碰到的问题；一些对细胞致命的蛋白质也不适宜通过双杂交系统来分析。双杂交只是反映蛋白质间能发生作用的可能性,这种可能还必须经过其他实验验证,尤其要与生理功能研究相结合,否则可能会误入歧途。 虽然如此,该技术已经成为许多实验室研究蛋白质的相互作用和蛋白质的结构与功能的必要手段。技术的发展与创新、研究成果的迅速共享为建立有机体的全部蛋白质(蛋白质组组分)的相互作用及其功能关系图谱提供了基础和条件。我们不奢望通过双杂交系统能发现所有真实的蛋白质相互作用,但在没有更好的方法问世之前,双杂交技术仍是开展这类研究的有力工具。
感谢吴家睿研究员对本稿提出了许多有益的建议。本课题组与此相关的研究工作是在国家自然科学基金和中国科学院多项基金等资助下进行的。
*Corresponding author： Tel, 86-21-64374430； Fax,86-21-64338357； e-mail, lil@sunm.shcnc.ac.cn
*联系人:Tel,021-64374430;Fax,021-64388357;e-mail,lil@sunm.shcnc.ac.cn
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14 Frederickson R M. Macromolecular matchmaking： advances intwo-hybrid and related technologies. Curr Opin Biotech, 1998, 9：90—98
二、蛋白质组学研究的完整解决方案
——Genomic Solution Inc.蛋白质组学研究系列仪器及软件
人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块”角色，随着破译生命密码的人类基因组计划进入尾声，一个以蛋白质和药物基因学为研究重点的后基因组时代已经拉开序幕，蛋白质将是今后的重点研究方向之一。然而，蛋白质的分离和鉴定非常费时，目前测定蛋白质的技术远远落后于破译基因组的工具，最好的实验室每天只能分离和识别出100种蛋白质。据估计，人体内可能有几十万种蛋白质，这大概需要10年时间进行识别。
为了加快蛋白质组学研究进程，以专业生产蛋白质组学研究设备而著称的美国GenomicSolutionInc.公司开发了完整的蛋白质组学解决方案，由一系列机械手臂与软件，并结合了二维电泳实验设备与质谱仪，可以进行高效、自动化且具重复性的试验分析。在Genomicsolution值得信赖的技术平台上，你的研究工作将更富成效，重复性更好。在这一整套Investigator平台上，各仪器之间配合无隙，由于它的整合性及标准性，使得研究进程大大加快，原来需要9—12个月才能获得数据结果发表的时间减少到9—12周。这套完整的系统具备蛋白质组研究所需的众多功能：2-D电泳、图像获取、2-D胶分析、蛋白样品切割、蛋白消化、MALDI样品准备、消化及点样、数据分析整合，再加上制备好的胶、试剂及附件，使研究工作可以立即展开。此套设备为进行蛋白质组学研究的利器,大大加速了蛋白质分离和鉴定的速度。该系统主要由以下几部分组成： 一、2-D电泳系统（Investigator? 2-D ElectophoresisSystem）
该系统主要进行2DPAGE第一向等电聚焦凝胶电泳和第二向SDS-PAGE电泳，设备包括2-D电泳系统所需的各种设备，如pHaser?（IPG胶条电泳）、管状制胶设备、二维电泳装置、电源设备、半导体冷却器及各种相关的蛋白纯化试剂盒。 产品特征：
* 提供2DPAGE电泳所需的各种设备，使电泳更加简便，大大节约研究时间
* 高分辨率：有效的第一向等电聚焦凝胶电泳和23cmX23cm第二向SDS-PAGE大面积板胶提供清晰的电泳图像，有效提高单体、磷酸化和糖基化蛋白的分离
*大容量：可同时容纳15块1mm一维管状胶，或8块2-3mm管状胶；10块IPG胶条和10块二维电泳板胶
* 灵活性：该系统用于管状胶、IPG胶条、预制胶、自制胶和SDS PAGE胶使用
*恒温：高效的半导体制冷装置保证电泳体系温度恒定，温度变化<0.5℃
* 专门为高分辨率2D PAGE而设计的电源系统
* 提供超纯的相关化学试剂和药品
二、蛋白凝胶成像系统（Investigator?ProImage）
ProImage专业的蛋白凝胶成像系统提供高灵敏度、高分辨率的大面积蛋白凝胶成像和分析。 产品特征：
* 高灵敏度，高分辨率数字成像系统
* 12bit冷CCD数码相机系统，大大提高图像信噪比
*提供白光和紫外光源,可对银染、荧光、胶片、考马斯亮蓝、EB染色图像进行数字化
* 可以配合HT PCAnalyzer蛋白质组学分析软件进行各种图像分析
*多用途暗箱，保证无任何光线泄漏，免除实验室的暗房设备
* 对高灵敏蛋白荧光染色剂SYPRO?Ruby染色图像进行最优化
* 光照均匀，最大成像面积达25 x 28 cm 三、蛋白质点自动切取机器人平台（Investigator?ProPic Workstation） Investigator?ProPic工作站主要用于2-D蛋白凝胶上蛋白质点的自动切取，可对考马斯亮蓝、银染、荧光染色的蛋白凝胶进行操作，广泛应用于制药公司、大学和重点研究所等进行高通量蛋白质组学研究的单位。InvestigatorProPic是第一个将2-D凝胶成像分析和蛋白质点自动切取两个功能整合在一起的机器人工作站，主要为蛋白质组学研究的后续分析采集和提供样品，该产品市场占有率在同类产品中最高。 产品组成：
*硬件部分：密闭暗箱及带有XYZ机器人手臂，具有100mm的切割精度，内置可换光源（白光和紫外光源），能容纳8块96微孔样品板的样品盘，并装配Gilson泵系统和12位高分辨率冷CCD数码相机的成像系统。凝胶成像和蛋白质点切取功能的整合，使得成像后凝胶不必移动而原位切取，避免移动过程中产生的位移和污染；切取结束后，可再次原位成像，检查切取结果准确性；可对操作过程实时监控。切取速度达120个/小时；全封闭的操作环境，有效防止角蛋白污染；超声水浴清洗和泵冲洗两种方式清洗枪头，有效防止样品交叉污染；污染最小化。内置水合装置，有效避免操作过程中因凝胶变干而影响切取准确性和样品回收率。 * 软件： HT Investigator PC Analyzer andDatabase,能进行高通量的蛋白凝胶图像分析，功能强大,处理量大；专业软件ProPic能自动控制数码相机曝光和切割机器人的采样操作；可由软件分析自动生成蛋白质点切取列表，亦可通过手动的point-click模式生成切取列表，在8小时的操作周期内无需专人管理，完全自动化，结果可靠。操作系统：MicrosoftWindows 98/NT。
四、蛋白凝胶图像分析专业软件（Investigator? HTPC Analyzer）
该软件适用于大规模、高通量蛋白质组学研究实验室，能快速处理大量2-D蛋白电泳凝胶图像，能够对蛋白质点进行自动识别、定量和比较；软件功能强大、界面友好，容易使用。
产品特征：
* 能自动识别、定量和比较2-D蛋白凝胶图像;
* 自动计算2-D凝胶上蛋白质点的分子量和pI值；
* 能自动生成蛋白表达量变化曲线或柱形图
*自动化、批处理和强大的编辑功能大大加快研究进程
* 通过创建True Average Gels克服样品和试验误差
*能进行半自动或全自动蛋白质点匹配，不需用户提供标记
*可对多块相应凝胶上的蛋白质点数据进行T-检验或其它统计分析;
* 数据可以传送给InvestigatorProPic?自动工作站进行蛋白质点自动切割;
* 带有HT PC数据库系统，可以方便进行蛋白研究的数据查询和数据管理; 五、自动化蛋白酶解工作站（Investigator?ProGest）
InvestigatorProGest自动化蛋白酶解工作站是进行全自动蛋白酶解的最佳选择，适合于从2D或SDS-PAGE胶上切取胶块的自动化酶解。通过触摸式显示屏界面方便地进行反应程序的设定，从而实现酶解过程中的自动清洗，加酶和恒温孵育步骤循环。 产品特征：
* 进行自动化、高通量的蛋白斑点酶解
*自动化操作和温控反应系统节约反应时间，提高反应效率，微处理器精确控制酶解反应条件
* 内置加热平台
* 专利的Flow-through技术，提高反应效率
*能够同时进行96个样品反应,每轮反应时间为6.5小时
*自动控制酶解反应循环时间，每天可进行两轮反应
* 氮气正压，超净环境
六、自动化MALDI点样工作站（Investigator? ProMSMALDI Spotting Workstation）
Investigator? ProMS系统用于蛋白质质谱分析前的样品浓缩、脱盐和MALDI点样,点样的多肽可以进行后续的质谱分析，ProMS适用于大多数商业化的MALDItarget。 产品特征：
*软件操作方便，可根据用户需要进行定制，应用灵活，可远程控制，高通量。
*溶液反应体系可对反应精确控制，多肽的反向洗脱增加检测灵敏度。
* 提供正压的干净空气
* 可以使用ZipTips?或类似产品
* 96孔规格
* 单泵分装
* 低流速（20 μl/min）增加纯化效率
七、自动化蛋白质酶解点样工作站（Investigator?ProPrep Workstation）
Investigator? ProPrepWorkstation将能够自动完成凝胶蛋白质点酶解及酶解后样品的浓缩，脱盐和MALDI点样等一系列过程，通过4个样品针头同时操作使得实验结果高效和自动化。该仪器简化了蛋白质组学研究的繁琐步骤，大大加快了研究的实验进程。酶解后的样品适用于多种后续分析，包括LC（液相色谱）和CE（毛细管电泳），尤其适用于质谱分析，如MALDITOF和MS/MS。该系统的酶解和MALDI点样两个操作过程可以分开单独进行，也可以整合成一个完整的过程进行自动化操作。 产品特征：
*多功能：同时具有自动化蛋白质酶解和MALDI点样功能
*高通量：酶解样品处理能力达1536个/天或更多；MALDI点样速度因方法和介质不同而不同
*无污染：独特的反应槽设计有效地防止样品交叉污染，HEPA滤过的干净操作环境，有效防止角蛋白污染；自动化操作减少了手动接触污染
*灵活性：提供4*96和8*96的样品盘满足不同通量的需求
* 操作方便：Window2000系统和15寸平面液晶显示屏使得操作更舒适方便；软件?操作简单，PC内置软驱和CD-ROM及10/100M网卡,使数据交换和共享更容易。
* 灵敏度达125 fmol 八、RADARS/MS?快速数据管理和检索系统（RapidData Archival and Retrieval System ）
作为Genomic SolutionsInc.公司旗舰产品的RADARS/MS?快速数据管理和检索软件系统，是一个完整的蛋白质组学研究智能平台。它整合了客户机/服务器，数据库和外联网（extranet）应用软件，可以方便地进行蛋白质的分析鉴定和传输。它提供目前最快、最可信和最完整的蛋白鉴定解决方案。通过RADARS/MS系统可以方便分析大量的蛋白质组学研究数据，快速发现和确认药靶及疾病标志物，尤其适合于蛋白质组学研究中心、重点实验室和制药公司。 特点：
* 能自动化分析大量质谱数据
* 蛋白序列和质谱数据自动对应
* 快速分析蛋白翻译后修饰位点
*蛋白组研究的实验数据和分析结果能进行快速数据库储存
*对MS和MS/MS结果数据能进行快速自动化的数据库查询和蛋白鉴定
* 提供清晰、有效的结果可视化和注释工具 Genomic SolutionInc.系列仪器及软件为蛋白质组学研究提供了完整的解决方案，大大加快了研究进程，提高了实验效率。该系统非常灵活，用户可以根据自己现有的设备情况，有选择性地配备GenomicSolutionInc.系列仪器及软件，形成适合自己的一整套完整蛋白组学研究系统。 Genomic Solutions references:
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生命科学是实验科学，因此生命科学的发展极大地依赖于实验技术的发展。以DNA序列分析技术为核心的基因组研究技术推动了基因组研究的日新月异，而以基因芯片技术为代表的基因表达研究技术为科学家了解基因表达规律立下汗马功劳。在蛋白质组研究中，二维电泳和质谱技术的黄金组合又为科学家掌握蛋白质表达规律再铸辉煌。蛋白质组学(proteomics)就是指研究蛋白质组的技术及这些研究得到的结果。
蛋白质组学的研究试图比较细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能。
蛋白质组学的研究内容包括：
1.蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。
2.翻译后修饰：很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。
3.蛋白质功能确定：如分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析。可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物-蛋白质的功能。另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解。Clontech的荧光蛋白表达系统就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工具。
4.对人类而言，蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康，主要指促进分子医学的发展。如寻找药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白质，而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也可以干预蛋白质-蛋白质相互作用。
在基础医学和疾病机理研究中，了解人不同发育、生长期和不同生理、病理条件下及不同细胞类型的基因表达的特点具有特别重要的意义。这些研究可能找到直接与特定生理或病理状态相关的分子，进一步为设计作用于特定靶分子的药物奠定基础。
不同发育、生长期和不同生理、病理条件下不同的细胞类型的基因表达是不一致的，因此对蛋白质表达的研究应该精确到细胞甚至亚细胞水平。可以利用免疫组织化学技术达到这个目的，但该技术的致命缺点是通量低。LCM技术可以精确地从组织切片中取出研究者感兴趣的细胞类型，因此LCM技术实际上是一种原位技术。取出的细胞用于蛋白质样品的制备，结合抗体芯片或二维电泳-质谱的技术路线，可以对蛋白质的表达进行原位的高通量的研究。很多研究采用匀浆组织制备蛋白质样品的技术路线，其研究结论值得怀疑，因为组织匀浆后不同细胞类型的蛋白质混杂在一起，最后得到的研究数据根本无法解释蛋白质在每类细胞中的表达情况。虽然培养细胞可以得到单一类型细胞，但体外培养的细胞很难模拟体内细胞的环境，因此这样研究得出的结论也很难用于解释在体实际情况。因此在研究中首先应该将不同细胞类型分离，分离出来的不同类型细胞可以用于基因表达研究，包括mRNA和蛋白质的表达。
LCM技术获得的细胞可以用于蛋白质样品的制备。可以根据需要制备总蛋白，或膜蛋白，或核蛋白等，也可以富集糖蛋白，或通过去除白蛋白来减少蛋白质类型的复杂程度。相关试剂盒均有厂商提供。
蛋白质样品中的不同类型的蛋白质可以通过二维电泳进行分离。二维电泳可以将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离。成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离。电泳后对胶进行高灵敏度的染色如银染和荧光染色。如果是比较两种样品之间蛋白质表达的异同，可以在同样条件下分别制备二者的蛋白质样品，然后在同样条件下进行二维电泳，染色后比较两块胶。也可以将二者的蛋白质样品分别用不同的荧光染料标记，然后两种蛋白质样品在一块胶上进行二维电泳的分离，最后通过荧光扫描技术分析结果。
胶染色后可以利用凝胶图象分析系统成像，然后通过分析软件对蛋白质点进行定量分析，并且对感兴趣的蛋白质点进行定位。通过专门的蛋白质点切割系统，可以将蛋白质点所在的胶区域进行精确切割。接着对胶中蛋白质进行酶切消化，酶切后的消化物经脱盐/浓缩处理后就可以通过点样系统将蛋白质点样到特定的材料的表面（MALDI-TOF）。最后这些蛋白质就可以在质谱系统中进行分析，从而得到蛋白质的定性数据;这些数据可以用于构建数据库或和已有的数据库进行比较分析。实际上像人类的血浆，尿液，脑脊液，乳腺，心脏，膀胱癌和磷状细胞癌及多种病原微生物的蛋白质样品的二维电泳数据库已经建立起来，研究者可以登录www.expasy.ch/www/tools.html等网站进行查询，并和自己的同类研究进行对比分析。
GenomicSolution可以为研究者提供除质谱外的所有蛋白质组学研究工具，包括二维电泳系统，成像系统及分析软件，胶切割系统，蛋白质消化浓缩工作站，点样工作站等；同时还可以提供相关试剂和消耗品。
LCM-二维电泳-质谱的技术路线是典型的一条蛋白质组学研究的技术路线，除此以外，LCM-抗体芯片也是一条重要的蛋白质组学研究的技术路线。即通过LCM技术获得感兴趣的细胞类型，制备细胞蛋白质样品，蛋白质经荧光染料标记后和抗体芯片杂交，从而可以比较两种样品蛋白质表达的异同。Clontech最近开发了一张抗体芯片，可以对378种膜蛋白和胞浆蛋白进行分析。该芯片同时配合了抗体芯片的全部操作过程的重要试剂，包括蛋白质制备试剂，蛋白质的荧光染料标记试剂，标记体系的纯化试剂，杂交试剂等。
对于蛋白质相互作用的研究，酵母双杂交和噬菌体展示技术无疑是很好的研究方法。Clontech开发的酵母双杂交系统和NEB公司开发的噬菌体展示技术可供研究者选用。
关于蛋白质组的研究，也可以将蛋白质组的部分或全部种类的蛋白质制作成蛋白质芯片，这样的蛋白质芯片可以用于蛋白质相互作用研究，蛋白表达研究和小分子蛋白结合研究。Science，Vol. 293，Issue 5537，2101-2105，September14，2001发表了一篇关于酵母蛋白质组芯片的论文。该文主要研究内容为：将酵母的5800个ORF表达成蛋白质并进行纯化点样制作芯片，然后用该芯片筛选钙调素和磷脂分子的相互作用分子。
最后有必要指出的是，传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质，而蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境(分子)的关系。因此蛋白质组学的研究通常是高通量的。适应这个要求，蛋白质组学相关研究工具通常都是高度自动化的系统，通量高而速度快，配合相应分析软件和数据库，研究者可以在最短的时间内处理最多的数据。 | | | |
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