RNA提取步骤及注意事项 细胞rna提取步骤

实验步骤如下:

  1.取50—100mg的组织,加入1ml Trizol试剂,用匀浆器打匀(Trizol先放于冰上)。

  2.将匀浆室温放置5min。

  3.加入200μl氯仿,剧烈震荡混匀30s,冰上静置3min。

  4.12000rpm,4℃离心15min。

  5.将上清液小心转移到新的1.5ml离心管中(取400μl),加入等量体积的异丙醇,上下颠倒几次混匀,室温下放置15min。(此步中注意:不要吸取任何中间层物质,宁缺勿烂。)

  6.12000rpm,4℃离心15min。

  7.小心移去上清液,防止RNA沉淀丢失。

  8.用70%乙醇(DEPC处理的水配制)洗涤1次,加入700μl乙醇,将RNA沉淀弹起,漂洗。(此时RNA是不溶解的)

  9.8000rpm,室温离心10min。

  10.尽可能彻底地吸走上清,防止RNA沉淀丢失。

  11.真空离心干燥3—5分钟,或放在室温下使乙醇完全挥发掉。

  12.沉淀用30μl DEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶,68℃处理10min。

RNA提取步骤及注意事项 细胞rna提取步骤

  13.RNA检测

  (1)测定样品在260nm和280nm的吸光值按1OD=40μg/ml RNA计算RNA的产量。

  OD260/OD280在1.8-2.0。

  (2)进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,确定RNA的完整性和污染情况。

注意事项:

1.获得RNA效率低有一下原因

a:样品裂解或匀浆处理不彻底

b:最后得到地RNA沉淀未完全溶解

2.A260/A280<1.65原因

a:检测吸光度时,RNA样品不是溶于TE,而是溶于水。低离子浓度和低PH条件下,A280值会较高

b:样品匀浆时加地试剂量太少

c:匀浆后样品未在室温放置2分钟

d:水相中混有有机相

e:最后得到地RNA沉淀未完全溶解

3.RNA降解原因

a:组织取出后没有马上处理或冷冻

b:样品或提取地RNA沉淀保存于-5--20度,未在-60--70度保存

c:细胞在胰酶处理时被破坏

d:溶液或离心管未经RBase去处理

  

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