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胰腺
胰腺移植是可以生理性严格控制维持血糖瞬间正常水平，治疗胰岛素依赖性糖尿病（IDDM）最有效的方法。研究发现，胰腺移植并且可以明显的改善糖尿病肾病、心脏疾病、周围血管疾病等并发症，甚至可以使部分并发症得以逆转。因此，目前的观点认为，胰腺移植的长期效果主要是逆转或防治糖尿病并发症的进一步发生、发展。本文也就近年来胰腺移植对糖尿病并发症的治疗做一综述。
一、胰腺移植治疗糖尿病肾病
大约有30%Ⅰ型及20%Ⅱ型糖尿病人并发糖尿病肾病，糖尿病肾病是引起终末期肾功能衰竭最常见的原因，一旦糖尿病肾病出现临床症状，控制血压可以延缓肾功能衰竭发生的速度，但外源胰岛素控制血糖并不能够延缓疾病的发展[1]。由于常常继发广泛的动脉血管疾病，同时伴有多器官的功能障碍，这些病人并不适于长期的血液透析,而采用胰肾联合移植可以使同时纠正糖尿病和尿毒症获得长期存活。由于持续血糖代谢的改善，与单纯的肾移植相比，接受胰肾联合移植病人的10年死亡率明显降低。Ojo等[2]认为对于年龄小于50岁、并发糖尿病肾病的病人实施胰肾同期联合移植（SPK），其糖尿病肾病的改善效果明显优于接受血液透析和单纯肾移植（KTA）的病人。
接受KTA的糖尿病受者，术后2年移植肾可以出现明显的糖尿病肾病的形态学改变。成功的胰肾联合移植可以保护移植肾发生糖尿病肾病，术后1~6.8年行移植肾活检，光镜下未见明显的糖尿病肾病的形态学改变，电镜观察也未见肾小球基底膜增厚等早期糖尿病肾病特征性变化[3]。Lefrancois等[4]于移植后10年检测了19例实施胰肾联合移植病人移植肾的形态和功能情况，其中11例移植胰和移植肾功能良好，8例于移植后1年移植胰功能丧失，发现移植胰功能丧失的病人尿蛋白量明显增多，肾小球和肾小管基底膜进行性增厚，肾小球和系膜体积增大，出现明显的糖尿病肾病的早期表现，而移植胰功能良好病人的肾脏无明显的形态学改变。表明通过胰腺移植来稳定血糖代谢，可以阻止移植肾糖尿病肾病的发生、发展,所以胰肾联合移植是目前治疗糖尿病肾病的最佳方法。
胰腺移植后是否可以逆转糖尿病肾病引起的实质性病变损伤？Fioretto等[5]报道胰腺移植对不伴尿毒症IDDM病人肾脏病变的作用效果，13例病人分别在移植前、移植后5年和移植后10年进行肾活检，发现随着移植后良好的控制血糖水平，增厚的肾小球和肾小管基底膜都有不同程度的改善，但逆转肾小球病变一般需要血糖代谢恢复正常至少5年以上。
二、胰腺移植治疗糖尿病神经功能障碍
接受胰腺移植的病人大多伴有进行性的糖尿病神经病变。外周神经病变包括感觉异常、感觉减退、肌肉无力和肌肉痉挛;自主神经功能障碍包括胃肠功能紊乱、性功能障碍、多汗和心血管功能障碍等。通常在接受胰肾联合移植后，随着血糖和肾功能恢复正常，神经功能障碍出现明显改善。
一般采用测量神经传导速度、感觉和运动神经的分布范围来研究外周神经病变的程度，神经传导速度的改善一般是在实施肾移植尿毒症症状好转3年以后，笔者的结果显示最早在术后3月就有明显改善。但只有成功的胰肾联合移植病人才出现稳定持续的多神经病变的改善，糖尿病肾病患者如果只接受单纯肾移植的病人糖尿病神经病变将继续发展[6]。
胰腺移植可明显改善糖尿病自主神经病变引起的内脏功能紊乱。Hathaway等[7]对比研究了糖尿病合并肾功能衰竭病人33例，其中23例接受胰肾同期联合移植和10例接受单纯肾移植病人心功能（R-R间期变异度，Valsalva比率）、血管收缩功能（毛细血管搏动幅度、毛细血管对温度的收缩反应、毛细血管对体位的反应）和胃肠功能（胃动电流描记、胃排空功能、全胃肠道症状评分法）的恢复效果，接受胰肾联合移植的病人于术后1年毛细血管对体位的反应、Valsalva比率、胃动电流描记、全胃肠道症状评分明显优于接受单纯肾移植的病人，说明胰肾联合移植可明显改善糖尿病自主神经病变，可以恢复正常的心功能、毛细血管收缩功能和胃肠功能。Allen等[8]于移植后8年对44例接受胰肾同期联合移植的病人行神经电生理检查，发现实施胰肾同期联合移植后神经动作电位的振幅出现持续的改善。Cashion等[9]检测了接受胰肾同期联合移植和单纯肾移植病人24小时的心率变异度，将24小时心率变异度作为自主神经恢复的指标，实施胰肾同期联合移植后心脏的自主神经功能出现明显的恢复和改善。
三、胰腺移植治疗糖尿病心脏病变
糖尿病并发心脏疾病主要是冠状动脉疾病、自主神经病变和糖尿病心肌病。糖尿病并发心脏疾病，特别是易发生充血性心力衰竭的病人，实施胰肾联合移植可明显的改善心功能和自主神经的病变。LaRocca等[10]对实施胰肾同期联合移植、单纯肾移植和血液透析的糖尿病人心血管疾病的死亡率、急性心肌梗塞、急性肺水肿以及高血压的发生率做对比研究发现，胰肾同期联合移植对糖尿病人的存活和心血管疾病的改善有明显的作用。
胰腺移植可以改善糖尿病人的心功能，对伴有高血压的情况，实施胰肾同期联合移植后得以好转，随着血压明显改善，急性心力衰竭和心肌梗死的发生率也降低。Fiorina[11]对42例胰肾同期联合移植和26例单纯肾移植的IDDM病人行左心室放射性核素成像检查发现，接受胰肾同期联合移植并且移植物存活4年的病人射血分数明显高于单纯肾移植的病人，而且接受胰肾同期联合移植病人的左心室舒张期各种功能指标也恢复到正常范围，舒张期功能障碍得以逆转。Gaber[12]等研究了胰肾同期联合移植和单纯肾移植对糖尿病人左心室的形态和心功能的影响，接受胰肾同期联合移植病人左心室形态和功能的改善明显优于接受单纯肾移植的病人，而且有75%的胰肾同期联合移植病人左心室的重量恢复正常。因此，实施胰肾同期联合移植对于心肺反射和心脏的收缩功能有明显改善，心脏舒张期最高灌注率和收缩期最高射血率均恢复正常，这与胰肾联合移植后代谢和心功能的改善密切相关，也就解释了接受胰肾同期联合移植的受者较接受单纯肾移植受者，其急性心力衰竭和肺水肿的发生率都比较低的原因，而且胰肾同期联合移植受者生存率的提高与心血管疾病的发生率比较低有关。
四、胰腺移植治疗糖尿病血管病变
胰腺移植对大血管病变的作用是目前仍有争议的问题。糖尿病病人接受胰肾同期联合移植或单纯肾移植后，大血管病变仍然不断发展。Biesenbach等[13]研究了胰肾同期联合移植和单纯肾移植对IDDM的脑血管、冠状动脉和外周血管疾病的影响，发现胰肾同期联合移植和单纯肾移植病人脑血管、冠状动脉和外周血管疾病均不能得以控制继续发展，两者之间差异并不显著。但接受胰肾同期联合移植病人的糖基化血红蛋白和甘油三脂明显低于单纯肾移植病人，认为胰肾同期联合移植能降低大血管疾病发生的危险因素，但不能阻止大血管疾病的进一步发展。
血管疾病的发生与多种因素有关，动脉硬化斑块通常是由动脉壁的局部因素所引起，这些因素在大血管疾病的发生中起重要作用。研究发现，胰腺移植可以减少动脉硬化发生的危险因素、改善内皮细胞的功能障碍和防止动脉内膜增厚，与单独肾移植相比，实施胰肾同期联合移植的IDDM病人其动脉硬化的危险因素要小得多。Fiorina等[14]检测了实施胰肾同期联合移植和单纯肾移植分别对糖尿病人动脉粥样硬化的发生危险因素、内皮细胞的功能以及内膜基质的厚度的影响，接受胰肾同期联合移植的病人动脉粥样硬化的危险因素明显小于接受单纯肾移植的病人，而且只有接受胰肾同期联合移植的病人具有正常的内皮细胞功能，血管内膜基质厚度明显减少。
胰腺移植对糖尿病微血管病变有明显的改善作用。通常采用测量皮肤的营养状况和血流量来反应糖尿病微血管病变的情况，研究发现，与单纯肾移植的病人相比，接受胰肾同期联合移植的病人其微血管的反应性以及对温度的调节能力出现明显好转，同时毛细血管内的氧张力、再次氧合时间、红细胞的流动速度和皮肤温度均得以改善。Cheung等[15]在显微镜下观察接受胰肾同期联合移植病人的甲襞毛细血管微循环的情况,在移植后1年内,其微循环的改善并不显著,移植后18个月,静息和充血状态下的毛细血管微循环均出现明显改善。
五、胰腺移植治疗糖尿病视网膜病变
目前胰腺移植对视网膜病变的效果还不确定，一些学者发现，胰肾同期联合移植和单纯肾移植对病人移植后2年视网膜病变以及视力的作用效果无明显的差异，而且视网膜病变仍继续发展，视力进一步减退。Ulbig等[16]在移植后71个月观察了25例接受胰肾同期联合移植的IDDM病人视网膜病变的效果，其中32%的病人视力有了明显改善，46%的病人玻璃体出血的次数明显减少、程度也明显减轻。Königsreiner等[17]报道胰腺移植后40个月，9%的病人视网膜病变得以改善，73%的病人病变稳定不再继续发展，18%的病人病变继续恶化，其中出现明显的视网膜病变改善的病人，其视网膜病变的程度都比较轻，提示只有处于早期视网膜病变的病人，胰腺移植对病变才有改善作用。最近Pearce和Chow等[18,19]报道，实施胰肾同期联合移植也可以稳定严重的增殖性糖尿病视网膜病变的继续发展，使病变得以控制。而Koznarova等[20]研究报道胰肾同期联合移植对病人视网膜病变的改善明显优于单纯肾移植，眼底镜检查发现，在接受胰肾同期联合移植的病人中，有21.3%的病人视网膜病变得以改善,61.7%的病人病变稳定不再继续发展, 17.0%的病人出现恶化；而单纯肾移植的病人中，有6.1%的病人得以改善,48.8%的病人病变稳定,45.1%的病人病变恶化，提出胰腺移植有利于糖尿病人视网膜病变的改善，甚至是在视网膜病变的晚期也有良好的效果。
胰腺移植是目前防治糖尿病肾病、糖尿病神经病变、糖尿病心脏病变、糖尿病血管病变和糖尿病视网膜病变等并发症的有效方法，甚至使部分糖尿病并发症得以逆转。胰肾联合移植对糖尿病并发症的治疗效果远远优于单独肾移植。
胰岛移植的主要适应症为胰岛素依赖型糖尿病（Insulin dependent diabetes mellitus,IDDM）,即Ⅰ型糖尿病。众多实验研究证实，胰岛移植不仅可以纠正实验动物的糖尿病状态，而且可有效地防止糖尿病微血管病变的发生、发展，促进糖代谢内环境稳定，降低死亡率。胰岛移植由于其手术低风险性、有效性而深受人们的重视。近年来，随着胰岛分离、纯化技术的不断改进以及新型免疫抑制剂的问世和应用，同种异体胰岛移植已取得突破性进展[1~3]，胰岛移植可能在今后数年内得以广泛开展。本文对这些方面的进展作一综述。
一、国际胰岛移植登记处的报告
国际胰岛移植登记处（International islet Transplant Registry,ITR）挂靠在德国Giessen的Justus-Liebig大学第三内科学院。最初的创立者为 K. Federling教授，现由Mathias D. Brendel博士负责。ITR在北美设有办事处，由Bernhard J.Hering博士任办公室主任。ITR的职责主要为收集、统计处理全球各中心胰岛移植病例的临床数据，分析移植成功和失败的经验教训，并对外宣布结果，促进胰岛移植的发展。其网址为：http://www.med.uni-giessen.de/itr/
据ITR最近公布（2001年6月）[1]的结果，截止到2000年12月31日，全球共有51个研究中心开展了493例成人胰岛移植，其中241例在北美，246例在欧洲，不依赖胰岛素的持续时间≥1、6、12、24、36、48和60个月的例数分别为66、54、40、22、11、6和2例。最长的自体胰岛移植后停用胰岛素者已达13年；最长的同种胰岛移植治疗Ⅰ型糖尿病不用胰岛素已达5年10个月；最长的胰岛移植治疗胰腺切除后糖尿病不用胰岛素达4年8个月。由于临床移植总的疗效仍不够理想，故全球年度移植例数近几年来一直徘徊于20～50例之间（图1）。
图1. 1974～2000年间同种成人胰岛移植的年度例数
国际胰岛移植登记处分析了1990～1999年间资料完善的病例，结果发现：按受者的糖尿病种类分，自体胰岛移植治疗胰腺切除后糖尿病者（主要为性胰腺炎受者）1年后有71%的受者不依赖胰岛素，表明现今的胰岛分离、纯化及移植技术已基本完善，移植后能使相当比例的患者摆脱注射胰岛素的困扰；而同种移植治疗胰腺切除后糖尿病（主要为上腹部累及多个脏器的恶性肿瘤患者）在1年后有47%的受者不依赖胰岛素，这表明受者若使用免疫抑制可使胰岛素不依赖率下降，提示现今的免疫抑制方案有一定的胰岛毒性，需要进一步改进。而在Ⅰ型糖尿病患者，移植1年后仅9%的病例能不依赖胰岛素，说明糖尿病的自身免疫因素对移植后胰岛的功能存活有着极大的影响（图2）。
图2 不同的糖尿病受者胰岛移植后的胰岛素不依赖率
由于胰岛移植主要针对的是Ⅰ型糖尿病患者，ITR重点分析了1990～1999年间237例术前C肽阴性的移植病例。一年患者存活率和移植物存活率（定义为基础C肽值≥0.5ng/ml）分别为96%和41%；移植一年后时不依赖胰岛素率为11%。分析这些不依赖胰岛素病例的共同特征，主要包括以下4个方面：
1、胰腺平均冷保存时间≤8小时。
2、植入的胰岛量≥6000个IEQ /kg体重（IEQ即胰岛当量，指直径相当于150μm的胰岛数量）。
3、免疫抑制诱导采用单克隆或多克隆抗T细胞抗体，最近联用抗IL－2受体的单克隆抗体的报道日趋增加。
4、植入途径经门静脉到肝脏。
若满足上述4个条件，其≥1年的不依赖胰岛素率可达24%；若至少不满足一个条件者，其1年时不依赖胰岛素率降为5% 。分析还表明，胰岛素依赖组和非依赖组在供、受者年龄、糖尿病病程、术前HbA1c水平、术前胰岛素的用量、冷缺血时间等方面无显著性差异（Fisher’s精确检验）。但胰岛素不依赖组在术后一月及一年时有更高的基础C肽分泌值（分别为2.88±0.45与1.71±0.22ng/ml，P=0.0361；以及2.27±0.16与0.75±0.12ng/ml，P<0.0001）。
二、Edmonton经验及新的免疫抑制方案
2000年6月，加拿 大EdmontonAlberta大学医院Shapiro领导的研究小组报告了他们的胰岛移植结果[2]，连续7例Ⅰ型糖尿病患者在接受移植后均停用了胰岛素。该组病人平均年龄44岁（29～54岁），IDDM病程平均35年，均有严重的低血糖反应及代谢不稳定表现。至报告时止，术后随访平均达11.9月（4.4～14.9月）。为了维持不依赖胰岛素状态，所有患者均接受了第二次来自另一供胰的胰岛移植；最重的一例还接受了第3次移植。患者住院平均2～3天，术后糖化血红蛋白正常，血清C肽上升（术前C肽均为阴性；术后3及6月时空腹C肽分别为2.4±0.3ng/ml，2.5±0.2ng/ml；餐后C肽分别为5.7±0.9ng/ml和5.7±0.6ng/ml），糖耐量试验基本正常，患者未再发生低血糖反应。稍后，这一令人鼓舞的结果再次被他们证实，17例移植受者全部于移植近期停用了胰岛素，在连续的15例受者中移植一年后仍有12例（占80％）不依赖胰岛素[3-4]。
如此高的移植成功率在历史上是绝无仅有的，故被ITR称为胰岛移植史上的一个里程碑，其方案被称为“EdmontonProtocol”。Edmonton研究中心成功的经验事实上主要包括以下几个方面：
1．严格的病例选择：患者有多年的糖尿病病史，术前C肽阴性，反复发作低血糖反应。患者术前均未致敏，PRA阴性，ABO血型相容，但未作HLA配型。
2．足够的移植数量：为保证停用胰岛素，移植的胰岛量至少为9000胰岛当量/kg（平均11547±1604胰岛当量/kg）。大多数病例均需2～3个供胰，2～3次移植，每次移植间隔时间小于1个月。
3．胰岛的分离在获得供胰后8小时内完成。
4．不含激素的免疫抑制方案：使用Daclizumab作免疫抑制诱导；以雷帕霉素（0.1mg/kg，维持血药浓度12～15ng/ml）和低剂量FK506（1mgbid，控制血药浓度3～6ng/ml）为主要免疫抑制剂。这种方案可达到预防排斥反应的目的而不造成致糖尿病的副作用。
这种不含激素的免疫抑制方案是Edmonton protocol中非常重要的一环。以下对主要的免疫抑制剂作一简介:
Daclizumab（zenapax），中文名赛呢哌，是一种人源化的抗CD25单克隆抗体，主要用于器官移植中急性排斥反应的预防。它特异性地作用于激活的T细胞上白介素2（IL－2）受体的α亚单位（Tac/CD25），通过竞争性地与IL－2受体结合，拮抗IL－2与IL－2受体结合所介导的T细胞增殖，从而发挥免疫抑制作用。它对胰岛无毒副作用，已广泛应用于肾、肝移植中。在EdmontonProtocol中，其用量为1mg/kg，术前开始使用，连续5剂，每次间隔14天。
FK506（Tacrolimus）是一种大环内酯抗生素，它可抑制淋巴因子的产生，多种白介素的表达（如IL－2、3、4、6、7）和IF－γ，抑制T辅助细胞依赖性B细胞的增殖，因此对导致移植物排斥的诸多因素可产生特异性抑制作用，现已成为临床移植中主要的免疫制剂之一，主要副作用包括致糖尿病作用、震颤、头痛、腹泻、高血压，其中致糖尿病作用与剂量关系很大。
雷帕霉素也是一种大环内酯类抗生素，现已进入临床试用。由于雷帕霉素与CsA、FK506在细胞内结合的蛋白不同，抑制免疫细胞的时相和途径不同，联合使用时在体内、外均显示良好的协同作用。
如今，Edmonton Protocol已推广至其他移植中心。Hering报告Minneapolis中心用此方案已成功地使3例移植受者停用了胰岛素。该中心与EdmontonProtocol的不同之处在于胰岛取自一个供胰，但移植前胰岛细胞先培养2天[5]。免疫耐受网（Immune ToleranceNetwork）现资助全球10个中心来共同验证Edmonton Protocol，其中有6个在美国（包括Minneapots,Miami等），3个在欧洲（德国的Giessen，意大利的Milan，瑞士的Geneva），1个在加拿大（Edmonton）。
三、 胰岛干细胞移植
由上述的Edmonton的研究计划可以看出，通过增加移植的胰岛数量和使用对胰岛无毒性的免疫抑制方案，可以大大提高术后的不依赖胰岛素率。但是，同种供胰的严重短缺，也必将限制这一方案的大规模推广。
为了能够为临床提供大量功能良好的移植物，定向诱导干细胞分化为胰岛细胞成为近年研究的又一热点。干细胞是既可自我更新，又能向多种细胞系分化的克隆形成细胞，可分为胚胎干细胞、脐血干细胞和成体干细胞三类。
胚胎干细胞具有以下的优点：细胞供应不受限制，功能稳定，可进行体外遗传修饰，以避免长期应用免疫抑制剂所致的副作用等；但还存在着许多需要解决的问题：（1）必须在增殖能力、无致瘤性和分化潜力间获得平衡，（2）任何用来移植的细胞必须是自体同源或免疫遮蔽的，（3）细胞必须具有均质性，否则可能生成畸胎瘤，（4）细胞必须具有稳定的表现型，（5）潜在的生物伦理方面的顾虑等。另外，胚胎干细胞诱导出的是同种异体移植物，术后仍然存在排斥反应而需要应用免疫抑制剂。
从脐血中分化、诱导出胰岛细胞是提供胰岛移植物的另一途径。脐血中有较多的干细胞，被视为一个容易获得的干细胞库，目前已有一些方法能有效的从脐血中分离出干细胞。脐血来源广泛，不存在伦理学问题，但与胚胎干细胞一样，诱导出的依然是同种异体移植物。
成体干细胞是在已分化的组织中仍处于未分化状态的细胞，它具有自我更新的能力，但其分化潜能较弱。而近来成体干细胞转分化技术研究表明，成体干细胞在一定微环境的作用下可以分化为需要的细胞和组织，从而起到治疗作用。目前认为成体胰岛干细胞存在于胰腺的导管细胞和胰岛之中。Zulewski[6]等从成人胰岛和胰腺导管分离得到干细胞样细胞，并发现它们在体外具有良好的增殖能力。Bonner-Weir等[7]通过体外培养人胰腺导管细胞，并成功诱导分化为胰岛样细胞。
成体干细胞是目前干细胞研究中的热点问题，主要的优点有：（1）分化成目标细胞的生物学步骤较短；（2）细胞来源无限；（3）允许自体移植，克服免疫排斥反应；（4）不存在伦理学问题。故成体干细胞是未来移植的方向。有关胰腺干细胞移植的研究进展将有另文介绍。
四、异种胰岛移植
解决供体来源的另一个可能途径便是异种移植。由于猪胰岛素在人类已有近一个世纪的应用史，充分证明了它的安全性和有效性，而且猪来源广泛，易于饲养，故猪成为最理想的供体选择之一。
成年猪胰岛的分离方法现已日臻完善，应用类似成人胰岛的胰管内胶原酶灌注自动分离法可成功地分离出大量活性良好的胰岛。Krickhahn等[8]报告应用LiberasePⅠ胶原酶分离4～6个月的小猪和2～3岁的老年猪，胰岛产量可分别达到3671±598IEQ/g组织和5182±545IEQ/g组织，胰岛的纯度分别达87%和92%，纯化后胰岛丢失较多，产量降为1669±386个IEQ/g组织和3209±444IEQ/g组织。胰岛的活力为80％～95%。灌注试验表明，纯化后的胰岛对葡萄糖刺激有良好的胰岛素释放反应。
理论上讲，由于猪胰岛细胞及内皮细胞表面存在大量的Gal-α1，3-Gal（Gal）分子，人及灵长类动物体内均有抗该分子的自然抗体，因而当猪胰岛植入人体或灵长类动物体内后，抗原与天然抗体结合，立即激活补体和凝血系统，产生膜攻击复合物（Membraneattack complex，Mac），导致移植物迅速死亡。张伟杰等[9]人采用间接免疫荧光染色法检测了人预存天然抗体与猪各种胰腺细胞的异种反应性及同种型，结果发现，55.6%的Ⅰ型糖尿病患者和55.0%的正常人体内均存在着抗猪内分泌细胞的天然抗体，但患者血清中强阳性的百分率更高。100%的患者和95%的对照血清都可同一种或多种胰腺细胞反应。预存天然抗体的同种型包括IgG和IgM两种。由于移植的组织通常并非绝对纯净的内分泌细胞，混杂的血管内皮细胞、导管细胞和巨噬细胞也能够诱导免疫反应，进而引起内分泌细胞的非特异性损伤。因此，这些非内分泌细胞应尽可能地清除掉。鉴于预存抗体同猪胰腺细胞的强阳性反应，作者指出移植前行供受者配型试验和移植物预处理可能利于移植的胰岛细胞的存活。
尽管存在着天然抗体等体液免疫参与排斥反应的基础，但一般认为，异种胰岛移植中的排斥反应仍以细胞免疫为主，主要由T细胞和巨噬细胞参与的细胞免疫为主，但其机理尚未完全阐明[10]。将猪或人的胰岛植入无胸腺的裸鼠体内可以长期存活即说明了这种免疫反应过程是T细胞介导的，其中CD4T细胞发挥了主要作用[11]。然而，使用能阻止T细胞反应的常用免疫抑制剂仅能延长异种胰岛的存活时间，而不能完全阻止免疫排斥反应发生[12]。Lehnert等[13]的研究还显示，具有高滴度的抗Gal抗体可以加速免疫排斥过程，损伤Gal阳性胰岛，这就提示，体液免疫亦参与了这种免疫排斥过程。大多此类实验均在啮齿类动物模型上完成，近年来陆续有在更具有价值的猪——非人灵长类动物模型上进行实验的报告。
Soderlund 等人[14]将胎猪胰岛样细胞团（Porcine islet-like cell clusters,ICCs）植入到非糖尿病猕猴肾包膜下，一组不使用任何免疫抑制剂，另一组使用环孢素A和15-脱氧精胍素,结果显示，在非免疫抑制组，6天内移植物中有大量巨噬细胞和CD8+T细胞浸润，仅见很少量B细胞，而在免疫抑制组，巨噬细胞和T细胞的浸润延后，但在12天时，亦可见大量巨噬细胞和T细胞浸润至植入的异种胰岛内，未见抗体或补体在移植物中沉积。因而，他们认为猪到人的异种胰岛移植的免疫排斥反应仍是以细胞免疫占主导地位的过程。
Wijkstrom 等[15]最近报告将成年猪胰岛植入恒河猴门静脉内，使用针对T细胞的免疫抑制剂,包括抗胸腺细胞球蛋白（ATG），抗白介素-2受体单克隆抗体，FK-506和雷帕霉素。至移植后22天仍可测得猪C肽，并可见胰岛素染色呈阳性的胰岛。胰岛内可见大量的巨噬细胞和T细胞浸润。但与Soderlund等人报道的不同，异种胰岛移植物内可测得IgG，IgM和补体，提示有体液免疫的因素参与了排斥过程。
Buhler等[16]在最近的一项研究中，将猪胰岛移植至狒狒的门静脉内，第1组在移植前切除受者胰腺，使用三联免疫抑制剂：抗胸腺细胞球蛋白（ATG）、环孢素和硫唑嘌呤；第二组则不切除受者胰腺，移植前进行全身及胸腺放射线照射，使用ATG,行体外抗Gal抗体免疫吸附，移植后使用眼镜蛇毒素，环孢素A及骁悉（MMF）、甲基强的松龙和抗CD-154单克隆抗体维持治疗，移植胰岛时还同时从外国静脉输入大量猪外周血祖细胞（progenitor）（3×1010细胞/kg体重）。实验结果显示：使用一般免疫治疗（第1组），植入的猪胰岛仅存活不到24小时，而第2组治疗方法，可使植入的胰岛存活超过14天，但在28天内遭排斥。Cantarovich[17]等也证实，将猪胰岛植入非糖尿病的灵长类动物门脉内（4例狒狒，1例猕猴），在ATG环孢素和骁悉，激素作为免疫抑制剂的情况下，猪肽的分泌不能维持超过24小时。这就说明强有力的先天性免疫反应参与了非协调性（discordant）异种胰岛移植的排斥反应过程。进一步应当继续探索有效的免疫抑制方法来克服异种胰岛移植的排斥反应。
较为系统地进行猪胰岛移植到人的临床尝试始于瑞典Uppsala大学的Groth等人。他们报告了10例Ⅰ型糖尿病患者接受胎猪胰岛细胞团的病例[18-19]。猪ICC经门静脉植入肝脏，使用CsA等常规免疫抑制剂。尽管所有患者的外源性胰岛素用量未减少，但有4例患者血、尿中均检测出了猪C肽，最高达4000Pmol/24h，持续至术后347天；此外，他们还获得了一例猪ICC在人体内存活的直接证据[20]：一例41岁的女性患Ⅰ型糖尿病伴终末期肾病的患者，接受了肾移植治疗。血管重建后在其肾被膜下植入410000个猪ICC。21天后，经细针穿刺获得植入的猪ICC组织。免疫组化证实在肾被膜下存在胰岛素及胰高血糖素染色阳性的细胞，超微病理亦进一步证实了胰岛细胞的存活。这对异种移植来说，无疑是一个良好的开端。
除了异种胰岛能否被人体免疫系统排斥外，近年来，人们还注意到异种移植时的微生物方面的安全问题[21]。猪体内的微生物如猪内源性逆转录病毒（PERVs）是否会将动物所患的疾病传染至人甚或造成灾难性的后果？从理论上讲，PERV可能会突变或者PERV的片段可与人内源性逆转录病毒（HERV）相结合产生新的病毒，而这种病毒可能是致病源。为此，Paradis等[22]观察了160例曾接受过异种细胞移植或体外灌注猪细胞的病人（包括肝细胞、胰岛细胞等），最长观察时间达12年，其中36人甚至应用了免疫抑制剂，另外还有23人微嵌合状态＞8-5年，但均未发现与猪有交叉感染情况的存在。尽管如此，人们依然十分强烈地关注着：异种移植能否产生病毒复制；这种病毒复制有无传播性；传播的病毒有无致病性；免疫抑制剂的应用是否增加疾病的易感性等等。
五、 新的免疫抑制方案及免疫耐受的诱导
胰岛移植后的最佳药物治疗方法应当是诱导受者产生仅针对移植胰岛的特异性免疫耐受，而不对机体的其他免疫功能产生影响[23]。与ITR所报告的类似，成功的诱导免疫耐受已在啮齿类动物中化学诱导的糖尿病模型中实现，但在大动物（非人灵长类）及自发性糖尿病模型中的成功率要低得多。常用的糖尿病模型有三种，一种是化学诱导的糖尿病，多用于大鼠、小鼠、仓鼠等的移植；一种为胰腺全切产生的糖尿病，多用于狗、猴等大动物；第三种为自发性糖尿病NOD小鼠和BB大鼠。前二种均不涉及自身免疫性胰岛损伤，只有第三种模型伴有胰岛炎、淋巴细胞浸润和自身抗体，符合临床上的Ⅰ型糖尿病的发现机理。
对治疗糖尿病而言, 理想的免疫耐受状态必须具有3个特点：① 没有针对供者特异性抗原的免疫反应所产生的对植入胰岛的破坏；②可避免自身免疫系统对β细胞的攻击；③不需要长期使用广谱的免疫抑制剂治疗。如何防止糖尿病的复发，如何在大动物身上延长移植物的存活，为新的免疫抑制方案及免疫耐受诱导方案中的研究重点。
目前，一种流行的方法为通过输注骨髓细胞造成嵌合(chimerism)来诱导耐受。Ikebukuro等[24]报告先对F334大鼠予9Gy的射线照射以去除淋巴细胞，而后同时经门静脉移植BN鼠的胰岛及骨髓细胞，5天后再追加一次经外周输注骨髓细胞，结果10/10只大鼠胰岛均可有功能存活一年以上。混合淋巴细胞培养表明，耐受大鼠的T细胞对供者抗原无反应，而对第三者抗原有正常的增殖表现，表明特异性耐受已经形成。在此模型中，经门静脉输注骨髓细胞及亚致死剂量射线的照射（9Gy）是关键因素。
Gauer等[25]通过外周输注MHC不相容性CD34＋干细胞及门脉内移植胰岛细胞，结果5/7只猕猴成功地停用胰岛素；而不输注干细胞者无一能长期存活，说明嵌合在诱导大动物的耐受中扮演了重要角色。
近年来，对CD40－CD154共刺激通路的研究成为一个新的热点。有证据表明[26~29]，通过抗CD154单克隆抗体来阻断此途径可以阻止同种移植物的排斥反应，移植物抗宿主病（GVHD），能够改变自身免疫的进程，阻止激活的巨噬细胞和内皮细胞介导的炎性反应。因此，抗CD154单克似乎特别适合于胰岛移植。Kenyon等[30]报告使用抗CD154单抗hu5c8作为唯一的免疫抑制剂，使6/6只胰腺切除的猕猴摆脱了外源性胰岛素，最长观察时间＞476天。混合淋巴细胞培养实现显示，5只猕猴对供者抗原呈特异性的免疫低反应，仅一只猕猴产生了针对供者的抗体。
传统的免疫抑制剂大都以钙调素抑制剂（环孢素和FK506）为免疫抑制基础，包括Edmonton研究中心在内的受者也使用FK506。鉴于钙调素抑制剂可产生致糖尿病的作用，而激素可造成受者对胰岛素的抵抗，故有人正尝试用新的免疫抑制剂来代替此二者，以进一步降低免疫抑制剂的副作用。Fu等[31]报告新型免疫调节剂FTY720可效地延长同种胰岛移植物在链脲霉素诱导的糖尿病小鼠及自发性糖尿病NOO小鼠的存活，其成功率（存活＞100天）分别达100％和50％。FTY720不仅对胰岛无破坏作用，反而可刺激胰岛细胞分泌胰岛素，提示其良好的应用前景。
阻断CD28/B7共刺激通路是另一个较为理想的无胰岛毒性免疫抑制方案和潜在的诱导免疫耐受方案[32~33]。有实验证明，使用CTLA4－Ig可在啮齿类动物和大动物中均可阻止T细胞的增殖，防止排斥反应的发生，在人类也有报告可阻止T细胞介导的自身免疫性皮肤病[33]，故它也有可能能够阻止糖尿病的复发。鉴于Edmontonprotocal中使用雷帕霉素、低剂量FK506及抗IL-IR单抗无激素方案的成功，Adams等[34]试图发展一种基于阻断CD28通路并连用雷帕霉素抗IL-IR单抗新的无钙调素抑制剂和激素的更加无毒的免疫抑制方案。结果表明，使用此方案可以抑制T、B细胞的反应，明显延长猕猴的同种抑制物的存活。
此外，也有报告使用抗CD3单克隆抗体[35]及联合使用维生素D和常规免疫抑制剂（环孢素，骁悉）[36，37]成功地诱导出免疫耐受，并防止糖尿病复发。
诱导异种移植的免疫耐受，难度要大得多。在同种异体移植，通过对免疫系统的不同处理，可以诱导出T细胞免疫受状态[38]。但在异种移植，如猪到狒狒的器官移植模型上，尚未成功地诱导出免疫耐受状态[39]。在此动物模型上，不但要诱导出T细胞免疫耐受，还需诱导出B细胞免疫耐受，才能永久地抑制针对猪抗原的抗体，因为这种针对猪的自然抗体所引起的排斥反应是不依赖T细胞的，这是目前未能诱导出异种免疫耐受的主要原因。另外还可能有其他因素参与了异种免疫排斥过程，即便是在某些不产生自然抗体的种系间，猪细胞的嵌合也更为困难，这可能与我们对异种排斥的机理尚不完全明了有关。如果能有效地抑制自然抗体的产生，如短时间内去除血液中的浆细胞，则移植表达Gal的猪细胞和器官就可能消除对Gal有反应的、成熟的B细胞。
另一种诱导免疫耐受的方法称为分子嵌合法。此方法是将产生α1，3半乳糖基转移酶基因转染狒狒骨髓细胞，然后将此狒狒进行全身致死量放射性照射，再将这些自体骨髓细胞回输给狒狒，从理论上说植入存活的具有Gal酶的骨髓细胞就可以消除可产生Gal抗体的B细胞。但是这种方法只在转基因小鼠获得了成功，但在猪到狒狒动物模型上未获得成功，难以大量地转染足够数量狒狒的骨髓细胞可能是主要原因[40]。
此外，尚有诱导T细胞免疫耐受的方法，该方法是将猪胸腺组织植入灵长类动物受者体内。目前认为，在实施异种移植时，猪胸腺组织必须已经血管化。有人尝试将胸腺组织注入自体猪供者肾包膜下，数周后，肾血管即可将植入的胸腺组织血管化，然后就可将这种所谓的“胸腺肾”移植至狒狒。狒狒的T淋巴细胞就可在猪胸腺组织内接受“训练”，从而达到选择性地去除对猪组织和细胞有反应的T细胞。此方法已在猪——小鼠异种移植及同种异体猪移植模型上获得成功，但在猪——狒狒模型上未获完全成功，其原因是受者体内存在大量的具有破坏作用的自然抗体[41，42]。
六、免疫隔离胰岛移植
自1980年Lim和 Sun首次采用alginate包裹胰岛移植成功以来，国外对此方面的研究方兴未艾。将胰岛置于一定形式的带有微孔的包囊内即可避免免疫活性细胞与移植入的胰岛细胞的直接接触，从而避免排斥反应，而胰岛细胞所分泌的小分子物质可以通过微孔弥散至包囊外进入血液循环。免疫隔离技术大体上可分为三种：第一种是血管内大包囊，这种大包囊内装有胰岛细胞，直接与血管吻合后有如动静脉瘘。第二种为血管外大包囊，亦即一个大的弥散腔，可植于许多血管外的部位。第三种为血管外微包囊，常植入腹膜腔。免疫隔离胰岛移植的优点在于：被包裹的细胞可选自异种供体，以及移植后可避免使用免疫抑制剂。上述3种免疫隔离技术在实验研究中均取得了成功，但在临床应用方面仍存在一些技术问题或不能满足正常的生理需求。
大量的实验研究结果表明，血管外包囊技术优于血管内包囊技术，并发症如血栓形成、感染发生率等较低。微包囊技术是将一个或数个胰岛包被于包囊中，因而其弥散力优于大包囊。虽然在动物实验中已能成功地逆转糖尿病动物包括大动物的高血糖状态[43]，1994年亦有成功应用于人类的报告[44]，但要广泛应用于临床仍需要克服种种困难。其临床应用障碍主要包括以下几方面：
1.制囊技术障碍就大多数实验来讲，基本制囊过程都一样，即：胰岛-alginate悬液流经一双腔喷嘴内腔，经由外腔喷出的气体吹打滴入CaCl2或BaCl2溶液成囊。这一传统制囊方法有两大缺点：一是囊的直径过大，一般在600～800μm。由于囊内细胞的营养完全依靠弥散获得，故这一弥散距离尤为重要。过大的“微囊”常导致胰岛的缺氧坏死，尤其是位于囊中心处的胰岛。二是囊的制作产率太低，假设治疗一个糖尿病病人需一百万个胰岛，而每个微囊包裹一个胰岛，则用这种气流制囊法仅制囊过程将耗时10小时以上。
针对上述缺陷，一些实验室近年另辟蹊径，掘弃了传统的气流制囊尝试静电制囊，其直径可缩小至0.25～0.35㎜，制囊时间可控制于5分钟之内。还有人设计出多喷嘴微囊发生器，其制囊时间也大大降低。但小微囊的一个缺点是：随着囊直径的缩小，部分胰岛不能被完全包裹，结果移植后未被包裹的胰岛部分实际上直接暴露于受体的免疫攻击之下。研究发现[45]，若囊的直径从800μm减少至500μm，则胰岛的不完全包裹率从6.3±1.2%增加到24.2±1.5%，移植效果反而低于大包裹。故如何改进制囊技术，克服这些矛盾，仍是今后一个很大的课题。
2.不完善的微囊的理化性质微囊化的胰岛不能无限制地存活于动物体内，主要解释为囊外的纤维包裹；而造成这种纤维增生反应的原因报道又相互对立。主要焦点在于纤维增生到底是由微囊本身引起，还是因包裹的细胞释放出抗原所致。理想的微包囊应该具有合适的半透性、良好的生物相容性及较高的机械稳定性。但迄今为止，无论以何种物质作免疫隔离材料均不能达到上述要求。为此，不断有改良的微囊出现，如用agarose代替alginate、用其它材料代替poly-L-lysine等。Jacobs等[46]提出了多层包裹的设想：即在常规制囊后在凝胶核的外围再包上2～3层复合物。每层复合物各司一个功能：最内层主管通透性；中间层加强机械稳定性，使囊不易破碎；最外层司生物相容性。由于每层复合物均由正负电荷相吸所构成，比共价结合的钡囊更为稳定。这一构思是新颖的，但仍有不少技术问题，如阻止制囊过程中微囊间的相互粘连以及生物相容性材料的寻找等亟待解决。也有人在微囊移植后，使用抗纤维形成因子和HOE077来减低囊外的纤维化反应[47]。
近年来alginate的纯化也取得一定进展。过去许多实验制囊采用的是商业用alginate，它含许多刺激因子，可激活巨噬细胞，引起IL-1和TNF-a的释放，诱导炎性反应及纤维增生。现在可采用特殊技术纯化alginate，使之不含内毒素等刺激因子，可明显减少纤维反应[48]。此外，alginate的化学成分对纤维反应的形成也有影响。Alginate主要包括两种成分：mannuronicacid （M）及guluronicacid（G）；不同的制作产品含不同的M/G比率。但高M还是高G的alginate更有利于包囊的生物相容性还有争论。亦有人认为，囊外的纤维反应主要与Alginate的纯度有关，其化学成分并不起主要作用。
许多研究结果显示，微囊化胰岛在化学诱导性糖尿病动物模型内存活时间较自发性糖尿病模型要长，而适当增加一些免疫抑制剂如CsA、CTLA4-Ig等可延长移植物的存活，暗示现今的微囊并不能达到完全免疫隔离的要求。有证据表明，APA膜的截留分子量<300KD。显然，这种膜不能屏蔽分子量更小的细胞因子。有鉴于此，在未来的临床移植中仍应从两方面入手，一应采用纯化的Alginate制囊，二在移植后给予适当的免疫抑制治疗仍是十分必要的。
3.缺乏一个合适的移植部分肝脏为胰岛移植中较为接近生理的一个部位，为临床移植所首选。但由于胰岛微包囊后移植容积大大增加，经门静脉植入后不可避免地会发生栓塞、门脉高压等并发症，所以微囊化胰岛的植入部位几乎只有一个选择即腹腔。而腹腔内移植又有种种弊端。一方面从胰岛的存活来讲，非微囊化胰岛移植后可完全再血管化，营养物质的供给得到保障，但微囊化胰岛则缺少这种血管化，所有营养物质仅靠腹腔液中的成分弥散获得；而腹腔又是低氧张力环境及缺乏细胞生存所必需的矿物质，其结果是微囊化的胰岛常出现中心坏死及体积缩小。另一方面从胰岛的功能来看，由于血液与胰岛之间缺乏直接的联系（即再血管化），不论是血糖升高的变化还是胰岛素释放入血的过程都必定要越过血液以及微包囊本身的弥散交换屏障，这样微囊化胰岛对血糖变化的刺激反应时间大大延迟。再者，腹腔移植后胰岛素释放进入体循环而不直接入门脉系统，这也要求移植更多数量的胰岛。因此，为了移植物的长期存活，替微囊化的胰岛寻找或营造一个合适的移植部位十分必要。
一个可能的选择是由polytetrafluouroethylene所制成的给养室，这种室由高生物相容性物质组成，可容纳大容积的微囊，并可包被酸性纤维细胞生长因子（a-FGF），诱导新生血管形成，从而使微囊化的胰岛和血液之间建立直接联系。这种将移植部位首先血管化、然后再将移植物植入预血管化的部位的方法，取得了良好的效果[49，50]。
结 语
1982年，当Sutherland报告第一批190例胰腺移植的临床结果时，只有19例移植物有功能存活，其中9例不依赖胰岛素超过一年，亦即当时仅5％的成功率。而今天，胰肾联合移植已成为公认的治疗糖尿病伴终末期肾病的首选方法。与胰腺移植相比，胰岛移植尽管还有许多困难需要克服，但Edmonton中心已证明了临床移植成功的可能性，Uppsala大学也证明了猪胰岛移植物在人体内的有功能存活，我们有理由相信，随着研究的深入，干细胞定向分化技术和免疫隔离技术的进一步完善，新的无胰岛毒性方案和免疫耐受诱导方案的成功，胰岛移植会在不远的将来使更多的糖尿病患者摆脱胰岛素注射的痛苦。
（中华医学会器官移植学会主任委员陈实教授）
