孕妇血浆DNA测序揭示胎儿的全基因组的遗传和基因突变 全基因组重测序

1. YM卢煜明¹，²，*，
2. KC的陈德源¹，²，
3. 的郝酥嗯¹，²，
4. 埃里克·的Z.陈¹，²，
5. 高培勇姜¹，²，
6. 菲奥娜的MF伦¹，²，
7. 阎王W.正¹，²，
8. 德Y.梁，
9. 子K.刘，
10. 查尔斯·R·康托尔⁴
11. 罗萨邱文贵¹，²

+作者背景

1. 
   ¹到母体血浆胎儿核酸，王子威尔斯亲王医院，沙田，新界，香港特区，中国香港，中国大学李嘉诚健康科学研究所，研究中心。
2. 
   ²，王子威尔斯亲王医院，沙田，新界，香港特区，中国香港，中国大学化学病理学系。
3. 
   
   ³妇产科，王子威尔斯亲王医院，沙田，新界，香港特区，中国香港，中国大学。
4. 
   ⁴采用Sequenom公司，SanDiego，CA 92121-1331，USA。

1. *向谁信件应该得到解决。电子邮件：loym@cuhk.edu.hk

无细胞胎儿DNA是存在于血浆中的孕妇。它由短的DNA片段之间的主要母源DNA片段。我们一个母体血浆DNA样本测序高达65倍基因组覆盖。我们发现，整个胎儿和母体的基因组孕妇血浆中表示在一个恒定的相对比例。血浆DNA分子表明可预测的分割图案，让人联想的核酸酶切割的核小体，与母亲的DNA相比时，示出了一个166碱基对（bp）峰相对于一个143-bp的峰值，减少与胎儿DNA。我们构建了全基因组的遗传图谱，并确定了突变状态的胎儿从母体血浆DNA序列，并从父亲的基因型和产妇的单倍型的信息。我们的研究表明，使用一种非侵入性的方式在产前诊断胎儿遗传性疾病的全基因组扫描的可行性。

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在怀孕期间，fetally来自孕妇的血浆中的中位数为10％的DNA（1，2），无创性产前诊断（3）提供了机会。到目前为止，检测的父系遗传因素[例如，性别（4）和恒河猴D血型组的状态（5）]和胎儿染色体非整倍体（6，7）是主要的应用。然而，很少有人知道孕妇血浆中胎儿DNA的物理和生物特性。循环胎儿DNA一贯报告短比母体的DNA（8），但是还没有已知的分子基础的这种观察。更好地了解这种规模的差异，可能会允许一个发展的方法从母体血浆胎儿DNA的选择性富集。它也不会知道母亲血浆中胎儿的整个基因组的代表。完全表示可能使人们有可能推断出的全基因组遗传图谱，甚至是整个基因组序列，非侵入性的胎儿。然而，这是一个技术上具有挑战性的任务，因为大多数（约90％）母体血浆中的DNA是来自从母亲的，并且在血浆中的DNA分子是短的片段（8）。在这里，我们使用配对末端（PE）的大规模并行测序研究的孕妇血浆中胎儿DNA的基因组序列和粒度分布。我们进一步构建了全基因组遗传图谱的胎儿从母体血浆DNA序列，并从父亲的基因型和产妇的单倍型的信息。

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临床病例

我们招募了怀孕的夫妇参加产科诊所的产前诊断β-地中海贫血。父亲是一个载体，中汽4个碱基对（bp）删除密码子41/42，怀孕的母亲是一个载体，A→G突变的的HBB基因（9）核苷酸-28。抽取血液样本的父亲和母亲在妊娠12周前绒毛取样（CVS）。的CVS的DNA的一部分被存储为研究对象。

单核苷酸多态性基因分型

从父亲和母亲的棕黄色大衣样品，和CVS样品中提取的DNA进行全基因组的单核苷酸多态性（SNP）?90万个SNP位点的基因分型，与Affymetrix公司的人的全基因组SNP阵列6.0系统（表S1）。个SNP位点被分为不同的类别（图1）。我们定义的类别1个SNP位点的父亲和母亲都是纯合子，但对于每一个不同的等位基因。第2类单核苷酸多态性的父亲和母亲都是纯合子，但同样的等位基因。类别3个SNPs的父亲是杂合子，母亲是纯合子。类别4个SNP位点为纯合子的父亲和母亲是杂合子。类别5个SNPs的父亲和母亲为杂合子。

无创胎儿的孕妇血浆DNA基因组分析。父母的SNP组合可以分为五个类别。1，2，和3的关键字允许母体血浆DNA测序，以建立，包括胎儿基因组，分数的胎儿DNA的浓度，和测序错误率的百分比覆盖率的基本参数。第3类还允许对胎儿的继承地位独特的SNP等位基因的父亲进行研究。突变唯一开展的父亲，被认为是第3类。第4类允许产妇的单倍型的继承地位的进行研究。一个应用程序是胎儿继承接近由母亲进行突变的单倍型块的跟踪。在这里，非侵入性的胎儿的基因组进行了分析，为家庭进行产前诊断β-地中海贫血。星号表示该信息需要对产妇单倍型的为RHDO分析。类别5个SNPs分析在这项研究中，但具有较强的奠基者效应与血缘父母或遗传性疾病常染色体隐性遗传性疾病的产前诊断为可能是有用的。

血浆DNA测序

我们进行的两端各50个基点，PE测序，从孕妇血浆中提取的DNA。榜（3.931亿美元），相当于65倍覆盖的人类基因组的一个平均，非重复掩模参考人类基因组（Hg18NCBI.36）的对齐。对于每45,392类别1个SNP位点在这个家庭中，胎儿预留杂合子。应该很容易发现胎儿的SNP位点遗传自父亲的孕妇血浆中作为一个独特的序列，可用于研究在母体血浆胎儿DNA序列在基因组中的分布。

图2A示出了父系继承胎儿母体血浆中观察到作为测序增加的深度为第1类的单核苷酸多态性的等位基因的数目的次数。随着从3.931亿读取数据，胎儿等位基因至少一次观察这些SNPs的93.94％（表S2）。这些结果均符合泊松分布的预测假设，整个均匀地分布在母体血浆胎儿基因组（图S1）。

孕妇血浆中胎儿和总DNA的测序。（甲）深度覆盖的胎儿特定的SNP等位位点的测序数与读取。（乙）测序深度和GC含量在整个基因组。染色体表意文字（外环）中的顺时针方向（着丝粒以黄色显示）面向pter-qter。其他曲目（从外侧向内侧）：GC含量（绿色，范围，30至55％），总测序深度（红色，范围，40?100读取数的SNP），和胎儿的特定的读测序深度（蓝色，范围，1?8中读取每SNP）。（Ç）的粒度分布胎儿的DNA（蓝色曲线），总DNA（红色曲线），线粒体DNA（绿色虚线）。数字表示的DNA的大小在峰值处。核小体的组织结构的示意图，示出在图形上方。从左至右，显示周围的核小体的核心单元，与核酸酶裂解位点的DNA双螺旋结构的伤口;?146bp的DNA（红色磁带）的核小体的核心单元，卷绕;和核小体的核心单元与一个完整的?20bp的接头序列。

的小数部分的胎儿DNA的浓度在母体血浆中，f，可以计算出从测序数据：其中，p是胎儿的特定等位基因（A等位基因为图1中的第1类的SNP） 和q测序读取的数目是读出的其他等位基因的计数，这是由母体和胎儿的基因组（第1类SNP在图1中的C等位基因）共享。染色体为每一个确定的值f的高度一致（表1）。胎儿和母体在整个基因组的序列（在1Mb的窗口）的覆盖范围的深度被绘制在图中。2B。它与每个基因组的窗口（图S2）的GC含量。胎儿序列作为比例在每个窗口中的总序列的数目是在染色体水平（表1）确定与小数胎儿DNA浓度一致。这些数据表明，在整个基因组中的胎儿和母体DNA的相对比例基本为常数。往前的数据表明，影响测量母体血浆中的总DNA是可能是一个分析的工件有关的测序平台使用（6，7，10，11），而不是表明的差分表示的DNA的GC偏置不同GC含量的分子。因此，我们的数据表明，孕妇血浆中胎儿和母体的基因组中的分布是比较均匀的。

分数胎儿DNA的浓度类1个SNP位点不同的染色体分析的基础上计算出来的。

高分辨率等离子DNA大小分析

可以推断，从基因组的端部坐标的PE读取每个定序的等离子体的DNA分子的大小。的尺寸的胎儿和总的序列测定的全基因组（图2C）和单独的每个染色体（图S3）。最丰富的总序列长度为166bp的（主要是产妇）。胎儿和总DNA的大小分布之间的最显着的差异是胎儿DNA表现出减少的166-bp的峰值（图2C），和一个相对突出的143-bp的峰值。后者可能对应的?20-bp的接头片段其?146bp的（12）的芯颗粒的核小体从修剪。从?143bp和以下，两个胎儿和总DNA的分布表现出了核酸酶切割的核小体（12）的10-bp的周期性让人想起。这些数据表明，血浆DNA片段来自DNA从细胞凋亡的酶促处理。与此相反，大小分析，读取映射到的非组蛋白结合的线粒体基因组没有表现出这种核小体的图案（图2C）。这些结果提供了分子解释为此前公布的规模胎儿与母体之间的DNA差异的Y染色体和选定的遗传多态性标记（8，13，14），并显示在整个基因组，这样的大小存在差异。

胎儿遗传图谱构建的一般原则

后表明，孕妇血浆中胎儿的整个基因组均匀地派代表出席了会议，我们试图建立一个全基因组遗传图谱的胎儿。孕妇血浆DNA分子很短的片段和胎儿的序列是少数。在这里，我们用亲本基因组的遗传结构作为支架组装胎儿从母体血浆DNA序列的遗传图谱。地图的分辨率取决于亲本的基因组上已知的解决方法。

首先，我们使用第2类单核苷酸多态性（图1），其中的父亲和母亲都是相同的等位基因纯合子，估计血浆DNA测序的错误率。2类为500457个SNP位点在这个家庭中，胎儿会是纯合子等位基因关注的。测序错误率表示的读取次数以一个意想不到的等位基因的比例读取第2类SNP位点，为0.303％（99467/32828899）。这些意外的等位基因被认为在4.04％，第2类SNP位点。假设，必须不止一次看到的等位基因得分，只有0.55％这样的SNPs有在至少两个观察读取，导致在99.45％，特异性为虚假的等位基因。然而，当施加到胎儿的特定等位基因的检测，要求两次读取减少了胎儿的等位基因检测灵敏度。父系遗传的胎儿等位基因看到至少有两次，第1类SNP位点，其中父母双方都为不同的等位基因纯合子（表S2）只有81.06％。

推导出胎儿的父系遗传

从父母双方各一个循序渐进的方式，我们推导出胎儿的继承。要确定胎儿的继承了父亲的等位基因，我们研究了129,835类别3个SNPs在父亲和母亲为杂合子纯合子的等位基因之一。每一个的两个父系基因有50％的机会被继承的胎儿。

特定的父本等位基因（的C等位基因在SNP基因3类; 图1所示），覆盖63962类别3个位点的测序读取之间检测到的至少一次和至少两次覆盖53070位点。CVS基因型数据表明，胎儿继承了父亲的特定等位基因的65,018类3个SNPs。观察到这样的父系遗传的胎儿等位基因至少有一次在61049（即，93.90％）和至少两次在52697（即，81.05％）位点，与第1类的SNP的值（表S2）的良好的一致性。如果我们认为是完美的基因分型，基因分型和序列的差异意味着测序父亲的特定等位基因2913和373类3个位点，分别观察一次或两次，是误报。由于CVS基因分型数据表明，胎儿的父亲继承了相同的等位基因在64,817个位点的等位基因纯合子的产妇，胎儿等位基因检测的具体使用一个和两个读的标准，分别为95.51和99.42％，分别为（表S2）。这些错误率与第2类的SNP的结果是一致的。

推导母体对胎儿的继承

母系遗传，我们分析了4类单核苷酸多态性（图1），母亲是杂合子，父亲是纯合子，并询问是否有轻微的等位基因失衡是存在于母体血浆中。表明，胎儿是一个产妇等位基因纯合子的不平衡。在原则上，这样的分析可以进行每个SNP与如数字聚合酶链反应（PCR）（15）的位点特异性的方法。然而，对于全基因组的随机测序，所需深度覆盖，因此，成本将是供临床使用望而却步。附近的SNP等位基因的单倍型在同一个母亲的染色体，我们开发了一种新的方法，以确定是否存在是一个相对的的单体型的剂量（RHDO）不平衡孕妇血浆中。由于减数分裂重组，最后的母源的单倍型的胎儿继承原有的两个母亲的单倍型的马赛克。继承从它的母亲的胎儿的等位基因的组合可以使用RHDO分析，然后被作为一个系列的继承块推导出。用于检测的分辨率取决于母亲的基因组遗传标记的数量和分布。

这证明了概念研究，我们推测产妇单倍型基因型分析，微阵列分析获得的信息的CVSRHDO需要的信息。这排除了直接观察母体减数分裂重组，但我们在以后的研究表明该方法可以检测出“人造”的母体减数分裂重组。产妇单倍型如果RHDO用于临床，可以推断出胎儿的信息没有任何比较与其他家庭成员的基因型信息。

图3显示RHDO过程。这两个产妇的单倍型HAP我和厦门II（图3A）。厦门我是的实际重组产妇染色体的胎儿继承。我们调查，，如果测序数据证明，胎儿产妇厦门一单倍型信息来自父亲的这种分析是没有必要的。

相对单体型的剂量（RHDO）分析。（甲）在α型SNP位点，父亲的基因是相同的产妇β型单核苷酸多态性等位基因厦门一中，父亲的基因是相同的产妇等位基因厦门II。如果胎儿从母亲继承了厦门我，它是α型纯合子和杂合子型β单核苷酸多态性。（乙）型α单核苷酸多态性，厦门我是孕妇血浆中过多。（Ç）对于β型单核苷酸多态性，是厦门我和厦门第二个SNP位点的累计计数没有显着的区别。在这种情况下，胎儿从父亲继承了厦门II，序贯概率比检验（SPRT）推导出的厦门我从母亲继承。

第4类单核苷酸多态性分为两种类型，需要不同的分析。我们定义的α单核苷酸多态性在父亲的基因是相同的，那些对孕产妇厦门（图3A）。我造成的胎儿的继承厦门厦门我的比例过高，相对于厦门II，孕妇血浆中（图3B）。如果胎儿继承了厦门II，没有人数过多，会被视为。我们定义的类型的β单核苷酸多态性在父亲的等位基因为我保持着对孕产妇厦门II（图3A）和胎儿的继承厦门的厦门我和厦门II孕妇血浆中的平等代表权（图3C）。但是，如果胎儿的继承厦门II，厦门II将偏高。一个序贯概率比检验（SPRT）确定的看到任何等位基因失衡（16）的统计显着性。SPRT允许假设检验数据的积累（17，18）。SPRT分类阈值时，胎儿的继承将建立一个特定的区域产妇单倍型（图4）。

SPRT分类。（甲和B）为RHDO分析型α（A）和（B）β型单核苷酸多态性的区域附近的1号染色体pterSPRT分类过程。在分类过程中运行的方向从端粒端的着丝粒。也参看表2和表3。

数据的一致性进行了检查两种方式。从单独分析的类型的α和β的SNPs的单倍型分配应该是相同的，并沿着染色体的RHDO使用的方向应该是独立的。RHDO类型的α和β型的SNPs靠近1号染色体的端粒末端段的段的分析示于图中。4和表2和表3。这两种类型的α和β型SNP分析推导出的继承厦门我的胎儿。表S3和S4说明的RHDO的的1和22号染色体的分析。1号染色体分析进行从端粒末端的p臂（pter）的q臂（qter），而反向的端粒末端。22号染色体分析进行从着丝粒qter，和反向。单倍型分类的RHDO类别分析，从两个方向是一致的。需要，的pter以qter1号染色体RHDO分析，以确定产妇平均17型α单核苷酸多态性和18型β单核苷酸多态性的单倍型的胎儿继承。三百一十四α型和267型的βRHDO分类进行了1号染色体（表三）。

SPRT分类过程RHDO型α单核苷酸多态性分析在区域1号染色体的pter。

SPRT分类过程为β型单核苷酸多态性中的区域附近的1号染色体pterRHDO分析。

表4总结了RHDO整个基因组的数据。分类细分为α型和βSNP位点分别为3863和3469，分别。由于厦门，我是母亲的单倍型传递给胎儿，任何厦门IIRHDO段的已分类不正确。如果所有的RHDO的分类进行直接解释的胎儿继承的单倍型，分别为25和43的错误RHDO分类为α型和βSNP位点，分别为（0.6和1.2％，这些分类）。目前的测序覆盖，α型和β分类段的平均粒径分别为659,000和768,000bp的。在这样的距离内的存在下2减数分裂重组将是不可能的（19）。因此，我们建议，接受只有当两个连续的相同类型的（即，α或β）RHDO分部表明相同的单倍型分类的单倍型中的开关。使用这个连续块的算法，我们获得了3和6不正确分类的类型的α和β的SNPs，分别为（0.08和这些分类的0.18％）（表4）。这种程度的分辨率是足够的用途，因为减数分裂重组发生一次每一代的每个染色体臂（19）。

（A）型α（B）型βSNP分类（pter qter）的准确性。

为了证明，RHDO过程中可能会发现产妇重组，我们介绍了1号染色体上的任意两个人工重组（163,000,000和204815000）和22号染色体上（位置34835000），通过改变fetally衍生的产妇单倍型在这些位置。图5是一个示意图，说明如何针对RHDO分析重组的位置。RHDO进行了分析，在两个方向上的染色体区域（从端粒端的着丝粒，着丝粒，端粒端）。进行当RHDO分析在第一方向上的着丝粒，端粒端（图5中所示），将指示的段数的RHDO分类为一个特定的单倍型（即，厦门Ⅰ）（图5）。当的RHDO段包围的重组位点达到中，RHDO分类会改变其他的单倍型（即，厦门II），如示于图。5。然而，结束SNP为RHDO分部之前（即，更端粒）前的实际的重组位点位于的变化在RHDO分类。RHDO分析，然后在相反的方向上进行（即，着丝粒端粒端）。在此之际，RHDO段，初步揭示了分类，厦门II。当达到重组RHDO段，分类会改变向Hap一同样，结束SNP为RHDO分部之前（即，着丝粒）位于的变化在RHDO分类前的实际的重组位点。前结束单核苷酸多态性的基因组位置在每个RHDO段分类所确定的正向和反向方向中的变化将附上的实际的重组位点。

使用RHDO分析重组位点的确定原则。（甲）RHDO分析一个染色体区域在两个方向上进行。小箭头，SPRT分类段，箭头总汇，具有相同的产妇单倍型;蓝色块箭，厦门我红色块箭，厦门II段划分。（乙）的SPRT曲线为绿色椭圆形的段内。厦门我等位基因的读取连续变化的部分的总贡献。的数据点在左侧，厦门的等位基因我所继承的胎儿，导致一，因此厦门的比例过高，则该部分将接近上的分类阈值时积累的数据点。然而，对于SNP位点远端的重组位点的等位基因厦门II继承的胎儿，导致的厦门我和厦门二读孕妇血浆中的平等代表权。因此，部分将接近0.5时积累更多的数据点。当分数低于较低的分类阈值，SPRT厦门第二分类。重组位点之间的最后一个SNP的RHDO段位于之前由RHDO在两个方向上进行的分析中的变化所确定的单倍型分类。

正确重组染色体1和22（表S5和S6）的RHDO分析显示从RHDO分部围绕引入的重组位点的单倍型分类的变化。在1号染色体RHDO分析，胎儿出现已继承厦门I从母亲的着丝粒的SNPrs1489331位于162956807（表S5），但产妇厦门II这点的远侧。这表明已发生的重组。1号染色体的的全RHDO分析表明两个重组162956807和163133120，204791360和204869063（表五）。22号染色体的分析RHDO表现为34636212和34835716（S6）之间的重组。对于这两个染色体中，推导出的重组点靠近人工引入的那些。

无创性产前诊断β-地中海贫血

接下来，我们采用了上述方法的产前诊断β-地中海贫血病，常染色体隐性遗传血液病。严重贫血的疾病，其特点是由于基因突变，在11号染色体上的HBB基因编码血红蛋白β亚基。受影响的胎儿必须继承来自父母双方的突变型等位基因，图6A示出的位置的父系和母系中HBB基因突变。DNA测序数据表明12读取与父亲的密码子41/42突变（图6B），表明胎儿继承了这种突变。一百一十八野生型序列读取41/42（图S4）被发现在密码子。明显的分数胎儿DNA的浓度为18％，与第1类SNP估计（见表1）兼容。

排序从母体血浆中β-地中海贫血的产前诊断。（甲）位置的母亲（核苷酸-28甲→G）和父亲（中汽删除密码子41/42）突变。蓝线，块型α单核苷酸多态性，粉红色的线条，块β型单核苷酸多态性;绿框，在β-珠蛋白集群的基因。（乙）观察到的序列进行中汽删除。（Ç）RHDO分析。蓝色和粉红色的框表示为α型和β型（蓝色）（粉红色）单核苷酸多态性的的SPRT分类块。每个方块中的SNPs的数目（第一行），累积的数目厦门I和厦门RHDO块（第二行），以及分类结果（第三行）内第二读取被示出。的框的位置，对应于（A）中所示的区域。

RHDO进行分析，以判断胎儿是否继承了产妇的核苷酸-28A→G突变。在这样的家庭，母亲厦门II-28突变的野生型等位基因是在厦门一型α和的βRHDO分析的（表七），均显示胎儿的继承厦门我从母亲（图。图6C）。这表明，胎儿继承了母亲的野生型等位基因。因此，对胎儿是一个杂合子β-地中海贫血的载体。

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无细胞胎儿DNA孕妇血浆中的发现，在1997年开辟了新的可能性，为无创性产前诊断（1）。然而，在此字段中的以前的工作通常集中在一个或少数母体血浆中的胎儿DNA的目标数目（5，20）的检测。在目前的工作中，它是不明确的，是否孕妇血浆中胎儿的整个基因组表示，和，是否孕妇血浆中胎儿和母体DNA的相对比例是不变的。例如，Puszyk等。用于实时PCR的量来评估的少数人血浆中的基因组位点，并报告说，它们的相对量是不同的（21）。在另一个例子中，风扇等。还提醒说，从孕妇血浆中的不同位点的序列表示可能不等于（7）。在这份报告中，我们使用了大规模并行测序表明，孕妇血浆中胎儿的整个基因组表示，目前在一个恒定的相对比例孕产妇孕妇血浆中的DNA（表1）。这个信息是很重要的，因为它表明从母体血浆胎儿的基因组是一种非侵入性的全基因组扫描可能的。在这里，我们使用β-地中海贫血的产前诊断孕妇血浆DNA的全基因组测序的一种非侵入性的方式。因此，全基因组的扫描胎儿的遗传性疾病的诊断也是可能的。随着大规模并行测序平台的错误率进一步减少，这可能是在母体血浆DNA测序成本效益的方式，可能是在胎儿基因组的从头突变可检测到。

的全基因组胎儿遗传分析，这里描述的是使用大规模平行测序检测胎儿染色体非整倍体（6，7）要复杂得多。对于非整倍体的检测，基本上只关心两个参数，即序列标签，这些标签映射到不同染色体的数量。比较，推导出了全基因组的胎儿的遗传图谱，人们必须分析测序数据的上下文中的亲本遗传图谱，并在一系列的胎儿的继承块组装这些数据。

例如胎儿的遗传分析的分辨率是有限的仅由深度的测序和亲本遗传图谱的分辨率。这证明了概念研究，产妇的单倍型推导出胎儿的基因型获得的信息，这些信息通过绒毛样品的分析。在现实的诊断的情况下，后者的信息将不会使用，产妇单倍型，可以推导出在多种方式：（i）在从其他家庭成员的基因型信息，（ii）在使用已知的单倍型内的信息的概率扣除种群;及（iii）由直接单倍型的信息被产生，例如，通过单分子分析（22，23）的方法，可让。随着越来越多的无障碍个体的全基因组测序，这是可能的，完整的基因组序列的父母将是可用的，或者可以产生相对低廉的价格与第三代的测序技术。在这种情况下，一个近乎完整的基因组序列的胎儿可以推断。从全基因组序列数据产生单倍型信息的最新进展，将有利于发展方向（24）。

阐明胎儿从母亲继承的RHDO方法有相对突变剂量（RMD）方法，该方法是基于数字PCR（15）的显着优势。的数字的基于PCR的方法，试图使分类的基础上一个单一的突变或多态性。通常，这将需要几千倍的目标区域的覆盖范围，以实现这一目标。为应用程序上的基因组范围内，这将是不切实际的，因为这些全基因组覆盖的制造成本将是禁止的。相反，在RHDO分析，统计的电源的方法已通过组合所有等位基因存在于相同的单倍型的计数从增强。作为一个结果，我们能够实现与65倍的基因组范围的全基因组分析。

的类别的5个SNPs（父母双方杂合子）（图1）分析，不能执行因为缺乏父系的单倍型信息设置为当前数据。然而，这两个亲本的单倍型被称为未来的研究中，如单核苷酸多态性将是有益的常染色体隐性遗传性疾病的产前诊断与血缘父母或遗传性疾病，具有强大的奠基者效应。因为他们的遗传相关疾病基因，每个家长都会有一个副本的疾病单倍型。RHDO分析就会发现孕妇血浆中的单倍型（S）胎儿继承。

我们的方法的无创性使得它比传统的程序需要的胎儿组织的损伤性取样（例如羊膜穿刺术，CVS）安全。然而，这种新方法的伦理，法律和社会问题，需要临床医生，科学家，伦理学家和社会各界的积极讨论，也引起了一些。此类问题的例子包括最适当的方式，提供遗传咨询这样一个相对复杂的测试，知情同意，频谱的胎儿遗传特征或异常，可以道德上测试，和平等问题提供一个相对昂贵的测试。这样的讨论已经正在进行中（25– 27），但将需要扩大。

一个未来的发展方向将是适用于描述的方法在这里专门为多种疾病相关的基因组区域，通过有针对性的测序方法（28，29）。以这种方式，一个可以定位在一个特定的人群中普遍存在的遗传性疾病。这种有针对性的方法会大大降低测序成本，并允许更多的样本进行分析，每测序运行。这样的发展也将允许考试科目的辅导，特别是集中组疾病。

我们的研究有助于阐明生物的血浆DNA揭示循环的胎儿和总DNA与高分辨率的大小差异。这是公认的，循环胎儿DNA分子一般都小于，产妇孕妇血浆中的DNA（8）。然而，这种观察的分子基础一直不清楚。风扇等。最近使用的PE测序研究的粒径分布的胎儿和总DNA孕妇血浆中（14）。但是，由于他们的研究只涉及1×10⁷读取每个样品，并用生物信息学算法，20bp的“箱中的数据进行了分析，”他们只能够复制的观察母体血浆胎儿DNA比母亲的DNA短（8），但均无法到达新机械的见解。在我们目前的研究中，我们产生了3.931×10⁹读取血浆中的研究样本，并用1-BP箱的，在我们的生物信息学分析。因此这种更高的分辨率，我们可以观察孕妇血浆中胎儿与母体之间的DNA差异，最重要的是减少166bp的峰值相对于143 bp的峰值（图2（c））。这种差异的最可能的解释是，循环胎儿DNA，包括多个分子?20-bp的接头片段已经从核小体修整。由于组蛋白H1结合的接头片段，这将是有趣的探索，针对H1抗体是否会优先绑定到孕妇血浆中的母源DNA，让丰富的循环胎儿DNA阴性选择。此外，H1是已知有一些变种，其中一些是呈现在表达式（30）中的组织特异性的变化。这些变种可能会进一步利用来区分胎儿DNA（主要是胎盘）从母体DNA（主要是造血干）（31）。

最后，我们的数据可能有一定的影响，用于其他领域，涉及检测血浆的核酸，如癌的诊断（32）和组织移植（33）监测。例如，这将是有趣的，调查的主要特点高分辨率的大小循环胎儿DNA的档案是否也可以看出，在循环肿瘤DNA与供体移植物来源的DNA。变化上RHDO方法也可能有用于检测肿瘤相关的遗传改变的应用程序。

材料和方法返回顶部

样品和处理

该项目是由中国联合大学，香港医院管理局新界东医院联网临床研究伦理委员会批准。从CVS与知情同意的孕妇和她的丈夫前收集的血液样本。外周血样品在1600克离心10分钟，在4℃下，在16,000克（34，35），在4℃的10分钟和等离子体部分recentrifuged。在2500克的血球部分recentrifuged，并除去任何残留的血浆。从血浆（4毫升）和血沉棕黄层的DNA萃取后血液和体液的QIAampDSP DNA血液Mini试剂盒（Qiagen公司）的协议。到最终体积为40微升每个案件后续的DNA测序文库制备的等离子体通过SpeedVac离心浓缩器（热，SAVANTDNA120）浓缩DNA。的QIAamp组织试剂盒（Qiagen）提取DNA从CVS的样品与。

微阵列基因分型

棕黄色大衣DNA的夫妇和CVSDNA的基因分型与Affymetrix公司的基因组范围的人类SNP阵列6.0系统如前所述（36）。简要地说，首先被消化的基因组DNA用限制性酶麦粒肿I.它，然后用T4DNA连接酶连接到一个共同的适配器。结扎后，该模板的PCR扩增。又一轮的消化，与NSP我和连接器PCR产物进行。然后将PCR产物为生物素标记的阵列，然后将荧光标记和扫描，得到每个探针的杂交强度的测定用基因芯片扫描仪30007G（Affymetrix公司）杂交。

Affymetrix基因芯片全基因组SNP6.0芯片被用来配合与Affymetrix公司的基因分型控制台版本2.1。对于父亲，孕产妇，和CVS的样本，99.1，94.5，和98.6％，分别的质量控制探针通过预设的质量控制参数。为906600的每个的三个样品的SNP位点的微阵列的信号与鸟食2.0算法（37），然后分析。的鸟食呼叫率>99％，每个样品。单核苷酸多态性（99.09％，898365/906600），成功地呼吁所有成员的三重奏（表S1A）。这些SNP位点，然后进行进一步过滤潜在的基因分型错误。首先，单核苷酸多态性与生物不可能基因型之间的三人组合已被删除（在传说中的详细说明，表S1）。因为大多数的孕妇血浆中的DNA分子是来自母亲的，我们进一步进行过滤单核苷酸多态性的母亲推导出的测序数据（在传说中的详细说明，表S1）基因分型错误的证据。这样的错误的推导是分开进行的，最初根据Affymetrix公司的数据作为类别1，3，和4标记的单核苷酸多态性。总共有0.60％（八百九十八分之五千四百零七，365）的SNP最初叫的鸟食，过滤。在这项研究中报告的数据，是根据从结果列表的892958个SNPs（的成功调用鸟食的单核苷酸多态性）的占99.40％（表S1）。

大规模平行测序

构建了与配对结束测序样品制备试剂盒（Illumina公司）从所提取的血浆DNA测序图书馆大多是根据制造商的说明。由于血浆中的DNA分子片段（8）的性质，我们省略了步骤碎片和大小选择通过凝胶电泳。简言之，DNA分子的末端修复用T4DNA聚合酶，Klenow聚合酶，并用T4多核苷酸激酶磷酸化的5′末端。A3′悬创建的3′-5′核酸外切酶缺陷的Klenow片段。适配器的寡核苷酸连接到粘性末端。适配器连接的DNA纯化直接用QIAquickPCR纯化试剂盒（Qiagen）的自旋列由15个循环的PCR与Illumina的引物和丰富。

地稀释，使得到PE测序流动池36时的DNA库进行杂交的DNA库。DNA团簇的生成Illumina公司群集站与配对完集群生成工具包v2的（Illumina公司），然后由51×2个周期的序列上的基因组分析仪IIx的（Illumina公司）与序列套件第三版（Illumina公司）。GenomeAnalyzer的测序控制软件（SCS）的2.5版，它可以执行实时的图像分析和基地呼叫，被用来进行图像处理和碱呼叫过程中的化学和成像周期的测序运行。我们使用了默认的参数在数据分析软件（SCSV2.5）从Illumina公司，过滤质量差的读取。贞节，是指最亮的和第二亮的强度的总和得到的最亮强度，计算各基站/周期。在默认设置下，读操作将被删除，如果小于0.6的贞操上观察到两个或两个以上的基地首批25个碱基。

序列比对和筛选

PE的短寡核苷酸比对程序（SOAP2）在PE模式（38）的测序数据进行了分析。对于每个PE读，从每端50bp的非重复掩模参照人类基因组（Hg18NCBI.36）对齐。如果在每个端部的取向，被允许最多两个核苷酸错配。这些潜在的基因组坐标为两端对齐，然后进行分析，以确定是否将允许以正确的方向的两端对齐到相同的染色体，跨越一个插入片段大小不超过约600bp的任意组合，并映射到一个参照人类基因组中的单个位置。

然后我们排序为重复读这些PE读取中。甲重复的读操作定义为一个PE读取其中插入DNA分子的显示相同的开始和结束位置上的人类基因组。我们删除了所有，但一个重复的PE的读取，因为他们可能产生的PCR过程中。其结果是，16.7％的产妇加总（胎儿）读取和17.4％的胎儿特定的读取，删除重复的读取。对于读取，横跨一个SNP位点，删除，读取揭示了生物不可能的等位基因的父亲和母亲的基因型确定由Affymetrix微阵列基因芯片。

RHDO分析

RHDO进行类4个SNP的母亲是杂合子，父亲是纯合子（图3）。RHDO分析可以从任何基因组的位置。在起始位置，覆盖在起始的SNP位点的两个等位基因的测序读取数首先被检查。SPRT（见购买以下部分）（16– 18）进行在开始的SNP位点的两个等位基因的计数之间的比，以确定是否是在等位基因平衡或不平衡，或的数据量是不足以达到统计的结论在这一点上。如果指示的数据的SNP位点的等位基因的平衡或不平衡，将得分作为厦门I或厦门II取决于它是否是一种类型的α或βSNP（见下文）。然而，给定的深度进行测序（几十读取每个SNP位点），将不会有足够的统计置信度作出数据只从一个SNP基因型呼叫。因此，数据将被视为“未分类”SPRT。SPRT进程将继续积累，读取计数的SNP位点，单倍型。过程一直持续到SNP位点的累计数据沿继承块达到足够的统计置信度得分为厦门我还是厦门II。附近的染色体1p端粒RHDO分析示出的的SPRT过程（图4和表2和3）。总之，积累的数据沿着从多个SNP位点的染色体等位基因失衡的证据加强。

用于移动单向沿染色体已知的基因组的单核苷酸多态性的顺序在被询问的单倍型。α型和β的单核苷酸多态性分别进行了分析（图3）。在α型SNP位点，那些对我造成的，孕妇血浆中的比例过高，相对于厦门II厦门我母亲的厦门厦门胎儿的继承了父亲的基因是相同的。如果胎儿继承了厦门II，没有人数过多，会被视为。父亲的基因在β型SNP位点，对孕产妇厦门II一样，和我保持胎儿的继承厦门厦门我和厦门II孕妇血浆中的平等代表权。但是，如果胎儿的继承厦门II，厦门II将偏高。后段的SNPs的单倍型呼叫，相同类型的下一个SNP，α或β，使用了到重新启动RHDO分析。重复该过程直到整个染色体或基因组区域的兴趣已分析。

SPRT分析

在Python（http://www.python.org/）编写的程序进行的的SPRT基于分类的RHDO。的比值比为1200，用于计算的阈值，用于接受空或替代的假说。零假设每个SPRT分析的剂量不平衡的情况下，的两个母系单倍型，厦门我和厦门II之间的读取计数。型α单核苷酸多态性，另一种假设是厦门一，对于β型单核苷酸多态性比例过高，另一种假设是：一，厦门的人数不足的原因，采用了高比值比为SPRT分类是不正确的分类考虑的机会减至最低SPRT的分类来进行全基因组的大量。SPRT的曲线的上部和下部的边界的计算，如先前描述的（16，39）。SPRT的曲线的上部和下部的边界的，用于计算的公式如下：q₀的总计数的比例如果胎儿从母亲继承厦门II提供的通过读取计数向Hap吾。q₁是贡献从厦门我读计数，如果胎儿继承了厦门我从母亲的总计数的比例。Ň读取计数的分类段的总数。LN表示自然对数（即，登录_é）。

型α单核苷酸多态性，胎儿会是杂合的，如果它继承了母亲从厦门II。因此，q₀是等于0.5。另外，如果胎儿厦门我从母亲那里继承的，它是纯合子等位基因遗传自父亲的。因为母亲是杂合子使用的单核苷酸多态性的RHDO分析，产妇等位基因胎儿的继承了母体血浆中过多。预期程度确定的分数在血浆中浓度的胎儿DNA的比例过高。在这种情况下，胎儿DNA浓度为11.43％。因此，该值将是0.5572（=0.5 + 0.1143 / 2）的q₁。

对于β型单核苷酸多态性，胎儿，如果它继承了厦门我的母亲是杂合子。因此，q₁是等于0.5。如果胎儿继承了来自母亲，厦门II上的等位基因厦门我会代表人数不足和任职人数不足的程度将取决于孕妇血浆中上的分数胎儿DNA的浓度。因此，该值将是0.4429（=0.5 – 0.1143 / 2）的q₀。

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图。S1。对胎儿的基因测序的数量预测的覆盖范围读取。

图。S2。深度之间的相关性的覆盖和GC含量在1-Mb的窗口（A）的整个基因组，和（B）在个体染色体内。

图。S3。孕妇血浆中个体染色体的胎儿和总DNA片段大小分布。

图。S4。清单野生型序列的测序读取密码子41/42HBB。

表S1。在所研究的家庭的不同类别的数量和比例的单核苷酸多态性。

表S2。不同类别的孕妇血浆中的单核苷酸多态性的检出率。

表S3。1号染色体RHDO分析。

表S4。22号染色体RHDO分析。

S5。RHDO1号染色体的分析，其中包括两个人工重组在163,000,000和204815000。

S6。RHDO22号染色体的分析，包括人工重组位点位于34835000。

表S7。RHDO分析为产妇的HBB基因突变。

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40. 资金来源：本研究由大学教育资助委员会，香港特别行政区政府，中国，根据地区的卓越计划（AoE/M-04/06），一般研究基金计划的香港研究资助局（CUHK463109），Sequenom公司赞助的研究协议，（圣地亚哥，CA），以及私人执业的香港中文大学妇产科系基金。YMDL是由李嘉诚基金会支持的一个得天独厚的椅子。的作者的贡献：YMDL，KCAC，并RWKC构思和设计的研究。CRC完善的研究设计。HS，EZC，PJ进行主要的生物信息学分析。FMFL和YWZ进行了测序和其他钳工工作。TYL和调景岭进行的临床特征和临床分子的相关性研究家庭。所有提供的数据分析和准备的稿子，批准的最终版本。竞争的利益：YMDL，KCAC，FMFL，YWZ，CRC，RWKC已经提交了专利申请和持有专利的胎儿在母体的核酸分析等离子。Sequenom公司已经授权给本专利组合的一部分。YMDL是一个顾问，临床顾问委员会，并持有在Sequenom公司的股票。CRC是Sequenom公司的首席科学官，并持有Sequenom公司的股票。已收到旅游RWKC支持，并YMDL曾在主办的会议，Illumina公司和LifeTechnologies，下一代DNA测序仪制造商。登录号：在国家生物技术信息中心的应用已经取得了沉积序列数据资料库的基因型和表型（dbGaP）。直到数据可在dbGaP，序列信息，可以得到从作者。

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科学译医学2012年6月4：137ra76

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