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线粒体与细胞凋亡
林其谁
(中国科学院上海生物化学研究所，分子生物学国家重点实验室，上海200031)
摘要 细胞凋亡是一种重要生物学过程，在细胞生长发育以及对外界刺激的反应中有关键的作用。近年来发现线粒体跨膜电位与线粒体通透性改变在细胞凋亡过程中起重要作用，并且提出了线粒体通透性改变孔道复合物的假说，引起广泛的注意。本文谨作一简单介绍。
关键词 细胞凋亡；线粒体；通透性改变孔道
线粒体是真核细胞的重要细胞器，是动物细胞生成ATP的主要地点。线粒体基质的三羧酸循环酶系通过底物脱氢氧化生成NADH。NADH通过线粒体内膜呼吸链氧化。与此同时，导致跨膜质子移位形成跨膜质子梯度和/或跨膜电位。线粒体内膜上的ATP合成酶利用跨膜质子梯度能量合成ATP。合成的ATP通过线粒体内膜ADP/ATP载体与细胞质中ADP交换进入细胞质，参与细胞的各种需能过程。
1951年Glucksmann提出正常脊椎动物发育中的细胞死亡。1966年Saunders提出在形态发生中细胞死亡。1972年Kerr提出细胞凋亡(apoptosis)，说明这是在组织动力学方面有广泛作用的一种基本生物学现象。1974年Lockshin提出细胞程序性死亡。美国麻省理工学院Horvitz在研究线虫发育时发现线虫的每个细胞的位置、分裂与命运都是由遗传决定的程序所精确地预先确定的。在构成成虫体时有1090个细胞诞生，131个细胞死亡。1993年袁钧瑛发现线虫的死亡基因ced-3的产物在结构和功能上与哺乳类白细胞介素1β转换酶有同源性。此后，属于同一家族的十几个相关基因陆续在哺乳动物基因组中被发现。统称为胱冬肽酶(caspases)。1994年Hengartner发现线虫的存活基因ced-9的产物与哺乳动物原癌基因bcl-2的产物相似。
细胞凋亡的特征是细胞由于降解酶，主要是水解酶（蛋白酶与核酸酶）的作用，在近乎正常的细胞质膜内趋向死亡。这与坏死时细胞质膜早期破损不同。在细胞凋亡过程中，质膜脂双层丧失二侧不对称性，磷脂酰丝氨酸暴露于细胞表面，从而导致被吞噬。
1 线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系
近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。而一旦线粒体跨膜电位耗散，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。线粒体解联的呼吸链会产生大量活性氧，氧化线粒体内膜上的心磷脂。实验证明，用解偶联剂mClCCP会导致淋巴细胞凋亡。而如果能稳定线粒体跨膜电位就能防止细胞凋亡。
2 线粒体通透性转变孔道
在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变，这是由于生成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道(PT孔道)(图1)。PT孔道由线粒体各部分的蛋白质与细胞质中蛋白质联合构成。这包括细胞液蛋白：己糖激酶，线粒体外膜蛋白：外周苯并二嗪(benzodiazepine)受体与电压依赖阴离子通道，线粒体膜间间隙蛋白：肌酸激酶，线粒体内膜蛋白：ADP-ATP载体，线粒体基质蛋白：亲环蛋白D(cyclophilinD)等。凡是能够专一作用于线粒体诱导PT孔道生成的物质，例如苯并二嗪受体的配基原卟啉IX等都能引起细胞凋亡。
Fig.1 Hypothetical model of the PT porecomplex［3］
The PT pore complex is made up by proteins from the cytosol(e.g.hexokinase，HK. which facilitates PT)，the outer mitochondrialmembrane(peripheral benzodiazepine receptor，PBR；voltage-dependentanion channel，VDAC)，the intermembrane space (creatinekinase，CK，which inhibits PT)，the inner membrane(adenine nucleotidetranslocator，ANT)，and the matrix(cyclophilin D). The exactstoichiometry and the sites of interaction of these proteins arenot known. Moreover，additional，yet unknown(?)proteins couldparticipate in the regulation of the complex. The conformation ofthe ANT，which is influenced by its endogenous(ADP，ATP)and exogenousligands(atractyloside，bongkrekic acid)，co-determines theprobability of PT pore opening. The interaction of cyclopohilin Dwith inner membrane proteins is also critical for PT pore opening.This interaction is inhibited by cyclosporin A(CsA)and thenonimmunosuppressive CsA derivative N-methyl-Val-4-CsA. Atpresent，it is not clear whether cyclophilin D interacts with theANT or other inner membrane structures. The opening of the PT poreis also facilitated by the oxidation of vicinal thiols located atthe matrix site of an inner mitochondrial membrane protein(possiblythe ANT). This oxi-dation is prevented by monovalent thiol-reactiveagents such as monochlorobiman or chloromethyl-X-rosamine. Itremains elusive whether these critical thiols are located withinthe ANT or other，yet unknown，PT pore components.
3 PT孔道的性质
通过一些实验室的研究，以下诸点值得指出：(1)线粒体内膜通透性转变既是细胞凋亡的必须条件，也是它的充足条件。(2)PT孔道打开后导致线粒体许多功能的致命性变化从而启动了死亡途径。(3)PT孔道作为许多生理效应的感受器（二价阳离子、ATP、ADP、NAD、ΔΨm、pH、巯基与多肽)，整合了电生理、氧化还原与细胞代谢状态的信息。(4)PT孔道的组成成分ADP-ATP载体是能量代谢的重要分子，由于ADP-ATP载体是由一个基因家族的几个成员所编码，它的表达有严格的组织专一性。因此，PT孔道在不同细胞中的调节可能稍有不同。(5)PT孔道的作用有自放大的效应。PT诱导ΔΨm耗散，而反过来mClCCP使ΔΨm去极化会导致PT。一些PT的结果例如ΔΨm 耗散，活性氧的生成本身也会导致PT。这就说明PT会有正反馈，从而在细胞凋亡中有自摧毁的作用。反过来，如果能防止ΔΨm的耗散，就能避免氧化还原不平衡、磷酯酰丝氨酸的暴露与蛋白酶和核酸酶的激活。
4 PT孔道的开放与关闭
PT孔道有开放与关闭二种构象。PT孔道开放导致细胞凋亡。而PT孔道关闭能防止细胞凋亡。当PT孔道与环孢菌素A(cyclosporinA)或SH，或米酵菌酸(bongkrekacid)结合时PT孔道被关闭。在PT孔道开放时线粒体释放细胞凋亡诱导因子(AIF)。AIF可能是一种蛋白水解酶，位于线粒体膜间间隙，它能被蛋白酶抑制剂如N-苄氧羰基-缬氨酰-丙氨酰-门冬氨酰氟甲基酮(N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone)所抑制。此外从线粒体释放的细胞色素C也是一种细胞凋亡诱导因子。虽然苍术苷与米酵菌酸都是ADP-ATP载体的抑制剂，但是它们对PT孔道的作用并不相同。苍术苷促进PT通道开放。这可能与二种抑制剂和ADP-ATP载体的结合部位不同有关。苍术苷只能与ADP-ATP载体的胞液侧结合而米酵菌酸可与ADP-ATP载体的胞液及基质二侧结合。
5 线粒体在细胞凋亡作用中的进一步证据
(1)若将纯化的正常的线粒体与纯化的细胞核在一起保温，并不导致细胞核的变化。但若将诱导生成PT孔道的线粒体与纯化的细胞核一同保温，细胞核即开始凋亡变化。(2)细胞死亡调节蛋白不论是抑制死亡的bcl-2家族还是促进细胞死亡的Bax家族均以线粒体作为靶细胞器。bcl-2蛋白的C端的疏水肽段能插入线粒体外膜。事实上相当量的bcl-2位于线粒体内外膜的接触位点。(3)高表达bcl-2能防止ΔΨm的耗散，从而导致对苍术苷、原卟啉IX与mClCCP的不敏感与AIF释放的抑制；反之，高表达Bax则导致ΔΨm的耗散。
综上所述，细胞凋亡与线粒体的结构与功能有着密切的关系。如果线粒体有大量PT孔道形成，细胞ATP浓度很快下降，则在致凋亡的蛋白酶被活化前细胞就坏死了。而如果PT孔道的诱导生成是一种比较缓和与持续的状态，在细胞ATP浓度下降前专一的蛋白酶被激活；而另一方面ΔΨm的耗散产生的超氧阴离子则导致细胞死亡。细胞凋亡是一把双刃剑。一方面是机体发育的正常过程，另一方面如果细胞凋亡过速，则会导致慢性退行性病变；如果细胞不凋亡就有可能导致癌变或对化疗的不敏感。进一步研究线粒体在细胞凋亡中的作用，有助于深入了解细胞凋亡的机制与对疾病的防治。
参考文献(References)
1 Kroemer G. The proto-oncogene Bcl-2 and its role in regulatingapoptosis. Nature Medicine，1997，3：614—620
2 Zamzami N，Susin S A，Marchetti P，Hirsch T，Gomez-Monterrey，CastedoM，Kroemer G. Mitochondrial control of nuclear apoptosis. J ExpMed，1996，183：1533—1544
3 Zamzami N，Hirsch T，Dallaporta B，Petit P X，Kroemer G.Mitochondrial implication in accidental and programmed celldeath：apoptosis and necrosis. J Bioenergetics &Biomembranes，1997，29：185—193
4 Whyte M. A link between cell-sulface receptors and ICEproteases. Trends in Cell Biol，1996，6：418
5 Wyllie A H. Apoptosis：an overview. British MedicalBulletin，1997，53：451—465
(本文原刊登在《生物化学与生物物理学报》1999年第2期
