ＤＮＡ粗提取草稿 如何提取草稿箱的邮件

DNA粗提取与鉴定实验12问

DNA粗提取与鉴定实验是高中生物教学中难度最大步骤最复杂的实验，也是一个可操作既有趣又有意义的实验。本人根据该实验的原理与步骤，结合指导学生完成本实验的教学实践和学生在实验操作中易发生的问题，设问12项并作答如下：

1、DNA粗提取的原料是鸡血细胞，可否用其他动物的血细胞替代？
答：本实验粗提取的DNA来自鸡血细胞核里的DNA，只能用鸟类的血细胞替代。不可用哺乳动物的血细胞，因为哺乳动物的血细胞无细胞核。
2、为什么要对新取来的鸡血液及时加入抗凝剂并搅拌？
答：新鲜血液加入抗凝剂（质量浓度为0.1g/ml的柠檬酸钠溶液）并搅拌，使血液与柠檬酸钠充分混合。防止血细胞凝集成团，影响血细胞的破碎和对血细胞里DNA的提取。
3、加入了抗凝剂的血液，为什么要在实验前一天放入冰箱（冷藏）或用离心机进行离心？
答：放入冰箱冷藏或离心的目的都是为了沉降血细胞。因为鸡血细胞与鸡血液的体积之比为1：3，沉降了血细胞之后，可除去上层约占2/3体积的血浆。在剩下的鸡血细胞液里，血细胞的相对数量增多，从中可提取的DNA物质会相对多一些。
4、如何使鸡血细胞核里的DNA释放出来？
答：首先对5~10ml鸡血细胞液加20ml蒸馏水，使血细胞在低渗环境里吸水膨胀，再加上快速搅拌的机械作用，加速了鸡血细胞细胞膜、核膜的破碎，细胞核里的DNA（实为结合着蛋白质的核蛋白）就释放出来了。用一层纱布过滤，除去细胞膜等较大的杂质，收集滤液。这是本实验的关键步骤之一，没有细胞核里DNA的释放，就没有实验结果，所以必须保证快速用力搅拌且时间在5min以上。
5、DNA被粗提取的原理是什么？
答：①在较高浓度的NaCl溶液（2mol/L）里，核蛋白解聚。随着NaCl溶液浓度的降低，DNA的溶解度降低，蛋白质的溶解度增大。所以，要对上述含有核蛋白的滤液加入40ml浓度为2mol/L的NaCl溶液，经搅拌使DNA在溶液里呈溶解状态，初步分离DNA与蛋白质。
②DNA在NaCl浓度为0.14mol/L时，溶解度最小而被析出。所以，对已溶解有DNA的溶液缓缓地加入蒸馏水，使含DNA的NaCl溶液浓度逐渐降至0.14mol/L（约需加入300ml蒸馏水）。用玻棒缓缓搅拌（玻璃有吸附DNA的作用），此时DNA以粘稠物状析出。三层纱布过滤，即可得到含DNA的粘稠物。这是本实验的关键步骤之二。
③DNA不溶于酒精，尤其冷却酒精更易使DNA发生凝集，而蛋白质等物质都溶于酒精。根据此原理可将DNA与蛋白质分离，并从NaCl溶液里将DNA提取出来。
6、在得到了含DNA的粘稠物时，为什么还要将此粘稠物再次溶于2mol/L的NaCl溶液中？
答：这是一次对DNA的粗提纯，使最后得到的DNA更纯一些、杂质更少一些。所以，要用钝头镊子将纱布上的粘稠物尽可能多的刮下，再次溶于2mol/L的NaCl溶液中。两层纱布过滤，除去杂质，取其滤液。
7、当析出的含DNA的粘稠物很少或没有析出时，有补救措施吗？
答：没有含DNA的粘稠物析出，就等于没有实验结果而前功尽弃。此时应将没有粘稠物滤出的滤液重新倒回大烧杯，或继续缓缓加入蒸馏水或先加入少量2mol/L的NaCl溶液再缓缓加入蒸馏水（前一种情况更多见，是学生急于过滤所致；后一种情况是学生加蒸馏水过快、过多，错过了0.14mol/L浓度值所致），重新调整NaCl溶液的浓度直到（0.14mol/L）有较多的含DNA的粘稠物析出时为止。
8、本实验共有七次搅拌，除第一次加抗凝剂的搅拌和第二次加蒸馏水使血细胞破碎的搅拌外，其余五次搅拌均要求沿一个方向轻搅。为什么？
答：因为自血细胞破碎后，就有大分子DNA物质进入了溶液。沿一个方向轻搅是为了保持DNA分子的完整性。最后提取到的DNA是以细丝状的形式缠绕在玻棒上。可以想象不是同一方向的乱搅就不会有这一结果了。
9、如何用纱布做好三次过滤？
答：本实验要用纱布做三次过滤，因每一次过滤的目的不同，所用纱布的层数也不相同。可在实验前准备一块手帕大小的纱布并蘸湿，根据过滤的需要进行不同层数的折叠。
第一次为提取鸡血细胞液的细胞核物质而进行的过滤。因为鸡血细胞的细胞核物质已释放入溶液了，所以此次过滤的目的是取滤液、除去细胞膜等杂质。用一层纱布过滤。
第二次为得到含DNA的粘稠物而进行的过滤。DNA在NaCl溶液浓度为0.14mol/L时，溶解度最小而以粘稠物的形式析出。所以此次过滤的目的是取滤出物（含DNA的粘稠物），除去滤液的。用三层纱布过滤。
第三次为得到相对较纯的DNA而进行的过滤。为了对含DNA的粘稠物进行提纯，将含DNA的粘稠物再次溶入2mol/L的NaCl溶液中。所以此次过滤的目的是取滤液，除去蛋白质等杂质。用二层纱布过滤。
10、DNA被鉴定的原理是什么？
答：二苯胺是定性鉴定DNA的试剂。DNA分子中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛，它再与二苯胺作用（100度条件下）生成兰色化合物。化学反应式如下：

所以，二苯胺试剂是将二苯胺粉末1.5g溶入100ml冰醋酸中,再加1.5ml浓硫酸(A液),与体积分数为0.2%的乙醛溶液(B液)按10:0.1的比例现兑现用。反应时，用100C沸水浴加热，最后出现兰色物的颜色深浅与提取到的DNA多少有关。
11、鉴定DNA时为什么同时使用了两支20ml的试管，都加入0.015mol/L浓度的NaCl溶液5ml和二苯胺试剂4ml？

答：其中的一只试管里插入了缠绕有DNA细丝的玻棒，另一只试管是DNA定性鉴定的空白对照，以表明兰色化合物确是二苯胺试剂与DNA反应生成的。又因为提取到的DNA很少，用二苯胺试剂鉴定生成的兰色化合物很少、颜色很浅，所以需要有一支对照试管，便于观察。
12、为什么本实验所用的大小烧杯、试管都要求是塑料质地的？
答：玻璃对DNA有吸附作用。由于细胞内DNA的含量本来就很少，用塑料质地的烧杯和试管可减少玻璃烧杯与试管对DNA的吸附，从而减少了提取过程中DNA的损失。

DNA的粗提取和鉴定实验步骤

制鸡血细胞液(加抗凝剂)→获得鸡血细胞(离心或静置)→获得鸡血细胞核物质(提核物质→溶解→析出→溶解→析出)→鉴定DNA(用二苯胺)

I.提取血细胞(柠檬酸钠、离心)Ⅱ.提取核物质(蒸馏水、过滤)

Ⅲ.用NaCl提取DNA(NaCl、过滤)Ⅳ.用酒精提取DNA(酒精、过滤)

V.用二苯胺鉴定DNA(二苯胺试剂)整个实验共“三次过滤，两次析出，五次搅拌”

注意事项

(1)血细胞液加水后，必须充分搅拌(不少于5min)，否则血细胞核不会充分破碎，溶解出的DNA就会减少。过滤时采用单层纱布。

(2)当NaCl溶液加入至血细胞滤液中之后，必须充分晃动烧杯，使二者混合均匀。这样才能使DNA充分溶解于浓NaCl溶液中。

(3)所用酒精必须是充分预冷(在冰箱中5℃以下冷却24h以上)才能使用。冷酒精与含DNA的NaCl溶液的体积比是2：1。提取DNA丝状物的方法是缓缓旋转玻棒。

(4)做步骤Ⅲ时加入蒸馏水的量应充足。

由于被稀释的原液体积仅为60mL左右，学生担心蒸馏水加过量，往往加到大半烧杯时就终止了。

(5)盛放鸡血细胞液的容器和实验中的烧杯及试管最好也是塑料制的，因为玻璃制品表面带电荷，DNA中的磷酸基带相反的电荷，会被吸附于玻璃表面，减少DNA含量。

1.制鸡血细胞。由教师课前完成，但要明确柠檬酸钠溶液的作用和离心、静置的目的。

2.获得鸡血细胞核物质。

a.应用低渗原理和机械搅拌使细胞破裂并过滤。这是关键步骤,直接决定提出的核物质多少及实验结果，教师指导操作。

b.溶解细胞核内的DNA:用2 mol/L的氯化钠溶液。

c.析出含DNA的黏稠物并过滤。这又是一关键步骤，教师亲自指导:

(1)要慢慢注入蒸馏水，防止加入过量再重新溶解(即把握浓度达到0.14 mo1／L)。

(2)轻轻沿一方向搅拌，有利于DNA的析出、附着、缠绕。

d.再溶解DNA的黏稠物并过滤。用浓度为2 mol/L的氯化钠溶液。

e.提取含杂质较少的DNA。用预冷的95%的酒精，原因:

(1)可抑制核酸水解酶活性，防止降解。

(2)降低分子运动，易于形成沉淀析出。

(3)低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。

注意观察丝状物的颜色。

3.DNA的鉴定。用二苯胺在沸水浴与DNA出现蓝色。

注意设立对照实验。

为了加深学生理解本实验过程各步骤使用的溶液，投影显示如下表格并讨论:

学生活动:讨论、回忆并回答。

①加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固

②加速血细胞破裂

③溶解DNA

④使2 mol／L的NaCl溶液稀释至0.14 mol／L使得DNA最大限度地析出

⑤使含DNA的黏稠物被留在纱布上

⑥使含DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中

⑦除去含DNA的滤液中的杂质

⑧提取DNA

⑨A:出现蓝色 B:无变化

最后推荐一道好题可用来加强对关键实验步骤的掌握：
在DNA的粗提取与鉴定试验中，需要在DNA的滤液中加入NaCl。当NaCl浓度为2mol/L和0.14mol/L时，分别是为了除去：
A.不溶性的杂质、溶液中的可溶性杂质B.可溶性的杂质、溶液中的可溶性杂质
C.可溶性的杂质、溶液中的不溶性杂质D.不溶性的杂质、溶液中的不溶性杂质

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