基因探针,即核酸探针,是一段带有检测标记,且顺序已知的,与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合,产生杂交信号,能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。根据杂交原理,作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件:①应是单链,若为双链,必须先行变性处理。②应带有容易被检测的标记。
基因探针的种类
总体上,基因探针可以分为人工合成的DNA探针和天然的克隆探针两钟。
人工合成的DNA探针(主要是指寡核苷醚探针)
用磷酸三酯法或亚磷酸三酯法等化学法人工合成,目前均由DNA合成仪合成。最常见的寡核苷酸探针长度在18~30个碱基之间。其特异性可以根据需要加以改变,以识别靶序列中单碱基变化。如果被测基因的序列已知,基因缺陷主要是点突变,可以人工合成一段与被测序列互补的寡苷酸探针。通常是两种寡核苷酸探针同时使用,一个与正常序列互补,一个与缺陷序列互补,通过分子杂交,将缺陷基因与正常基因区别开来。
天然的克隆探针是对天然核酸序列进行克隆得到,大致包括cDNA探针、基因组探针、RNA探针、内含子序列探针和小卫星DNA探针等。最常见的有三种:①cDNA探针:经典方法是先从细胞总RNA中分离出mRNA,再由逆转录途径从mRNA合成cDNA,构建cDNA文库,并用适当方法从文库中筛选出所需的cDNA克隆。也可应用PCR法从总RNA构建cDNA文库,再克隆到某种质粒中,经细菌扩增,可得大量的重组质粒。通过限制性内切酶切下特异cDNA,再进行标记,即可获得用于杂交的探针。②基因组探针:这类探针是直接从人基因文库中筛选而得,故包含内含子序列。其制备过程大致如下:将人基因组DNA切割成20kb左右的片断,以λDNA为载体,组建成包括所有人类基因的基因文库。从基因文库中可以筛选出各种特定的基因重组体,再经次级克隆,将一段特异基因重组到不同质粒上。经筛选、扩增后,抽提质粒DNA,并用限制性内切酶切下特异DNA片断,再进行标记,制成基因组探针(见图1)。③RNA探针:将一段已知的基因序列重组在细菌启动子的后面,在细菌RNA聚合酶的作用下,加入标记底物,就可合成拷贝数很高的RNA探针。RNA探针的特征是单链、与DNA结合更牢、拷贝数高、容易制备。天然的克隆探针具有较长的序列和更高的复杂性,因而通常要比寡核苷酸探针具有更高的特异性,一般也容易获得较强的杂交信号。