从番茄中提取番茄红素和B-胡萝卜素 番茄红素与胡萝卜素

从番茄中提取番茄红素和B-胡萝卜素

一、引言
番茄中含有番茄红素和少量的B-胡萝卜素,二者均属于类胡萝卜素。类胡萝卜素为多烯类色素,不溶于水而溶于脂溶性有机溶剂。本实验先用乙醇将番茄中的水脱去,再用二氯甲烷萃取类胡萝卜素。因为二氯甲烷不与水混溶,故只有除去水分后才能有效地从组织中萃取出类胡萝卜素。根据番茄红素与B-胡萝卜素极性的差别,用柱层析可以将它们分离。分离效果可以用薄层层析进行检验。


二、实验材料和试剂
新鲜番茄(或番茄酱)。
从番茄中提取番茄红素和B-胡萝卜素 番茄红素与胡萝卜素
95%乙醇;二氯甲烷;石油醚(60~90℃);氯仿;中性或酸性氧化铝(柱层析用);环乙烷;硅胶G;饱和氯化钠溶液;无水硫酸钠。
三、实验步骤
1. 原料处理与色素提取
称取新鲜番茄浆[1]20g于100ml圆底烧瓶中,加95%乙醇40ml,摇匀,装上回流冷凝管,在水浴上加热回流5分钟,趁热抽滤,只将溶液倒出,残渣留在瓶内,加入30ml二氯甲烷,水浴上加热回流5分钟,将上层溶液倾出抽滤,固体仍保留在烧瓶内,再加10ml二氯甲烷重复萃取一次。合并乙醇和两次二氯甲烷提取液,倒入分液漏斗中,加5ml饱和氯化钠溶液(有利分层),振摇,静置分层。分出橙黄色有机相,使其流经一个在颈部塞有疏松棉花且在棉花上铺一层1cm厚的无水硫酸钠的三角漏斗,以除去微量水分。将此溶液储存于干燥的有塞子的锥形瓶中。层析之前,将此溶液在通风橱中用热水浴蒸发至干。
2. 柱层析分离
取一支长15cm左右内径为1~1.2cm的层析柱,柱内装有用石油醚调制的氧化铝[2]。将粗制的类胡萝卜素溶解于4ml苯中,用滴管在氧化铝表面附近沿柱壁缓缓加入柱中(留1~2滴供以后的薄层层析用),打开活塞,至有色物料在拄顶刚流干时即关闭活塞。用滴管取几毫升石油醚,沿柱壁洗下色素,并通过放出溶剂至柱顶刚流干,从而使色素吸附在柱上。然后加大量的石油醚洗脱。黄色的B-胡萝卜素在柱中移动较快,红色的番茄红素移动较慢。收集洗脱液至黄色的B-胡萝卜素从柱上完全除去,然后用极性较大的氯仿作洗脱剂洗脱番茄红素(注意更换接收瓶)。将收集到的两个部分在通风橱内用热水浴蒸发至干。将样品分别溶于尽可能少的二氯甲烷中,尽快进行薄层层析。
3. 薄层层析检验
在用硅胶G铺成的薄板[3]上距离底边约1cm处,分别用毛细管点上三个样品,中间点为未分离的混合物,两边分别点上分离得到的B-胡萝卜素和番茄红素。可以多次点样,即点完一次,待溶剂挥发后再在原来的位置上点样。但要注意,必须在同一位置上点,而且样品斑点尽量小。点样时毛细管只要轻轻接触板面即可,切不可划破硅胶层。样品之间的距离为1~1.5cm。将此板放入装有环已烷作展开剂的层析缸中,盖上盖子。切勿让展开剂浸没样品斑点。待溶剂展开至10cm左右时,取出层析板。因斑点会氧化而迅速消失,故要用铅笔立即圈出。计算不同样品的R1值,比较不同样品R1值大小的原因以及分离效果。
四、注释
[1 ] 新鲜番茄浆的制备:将新鲜番茄洗净,用捣碎机捣碎或用市售的番茄酱。
[2]氧化铝层析柱的装填方法:将层析柱垂直固定于铁架上,铺上一层薄薄的石英砂,关闭活塞。称取15g氧化铝置于50ml锥形瓶中,加入15ml石油醚(顺序不能反)边加边搅,且不断旋摇直至成均匀浆液(稠厚但能流动),向柱内加入溶剂(石油醚)至半满,然后开启活塞让溶剂以每秒一滴的速度流入小锥瓶中,摇动浆液,不断地逐渐倾入正在流出溶剂的柱子中,不断用木棒或带橡皮管的玻璃棒轻轻敲击柱身,使顶部成水平面,将收集到的溶剂在柱内反复循环几次,以保证沉降完全和装紧柱。整个过程不能让柱流干。待溶剂刚好放至柱顶刚变干时即可上样。
[3] 硅胶G薄层板的制备:将4g硅胶G置于一小烧杯中,加入8ml蒸馏水不断搅拌至浆糊状,倾倒在洗净的玻板上(18 x6cm),流平,或用涂布器铺板,并轻轻敲打均匀,在室温放置半小时凉干,然后移入烘箱,缓慢升温至105~110℃恒温活化半小时,取出放入干燥器中备用。


(三)β-胡萝卜素提取

1.将胡萝卜切碎,充分研磨,后放入试管
2.向试管中加入酒精
3.把试管用试管夹夹住,放入加有水的烧杯中(注意:不要将试管挨着烧杯壁)
4.用酒精灯加热烧杯(水浴加热),这样它们就溶在酒精里了

(四)β-胡萝卜素提取

一、贵重仪器

旋转蒸发器一台

UV-240型紫外-可见分光光度计一台

电热干燥箱一台

二、常规仪器

层析柱(20x700mm)一根

铁架台一套

锥形瓶 500ml二个

 50ml五个

烧杯 500ml二个

滴液漏斗  500ml一个

量筒 500ml、50ml各一个

玻璃棒100cm一个

20cm二个

研钵一套

滴管二个

三、试剂

80-100目柱层析硅胶青岛海洋化工厂分厂

60-90℃石油醚北京化工厂AR

乙醇北京化工厂AR

乙酸乙脂北京化工三厂AR

无水Na2SO4天津市塘沽邓中化工厂CP

1% AgNO3水溶液(自制)

pH试纸

胡萝卜(自备)

四、实验步骤

1、提取

2、柱层析

3、结构表征-胡萝卜素的UV分析

具体实验步骤见讲义2-3页有关内容。

五、实验记录及讨论

1、本实验在提取操作中进行了实验性尝试,在研磨过程中加入了3g的无水Na2SO4以增强研磨强度,有利于有效成分的提取。在选用提取液时未使用乙醇,而使用了15ml乙醚,10ml丙酮X2次,10ml石油醚X5次,采用在研钵中加提取剂,研磨,然后倾其上层液体抽滤。这样避免了将混合物全部倒入漏斗,造成抽滤难以进行的后果。

2、本实验中耗时最多的一步操作是硅胶的处理过程:

第一、硅胶的预处理,我们以浓盐酸浸泡硅胶14小时,然后用蒸馏水洗涤硅胶4次后,将起进行减压抽滤,后不断加蒸馏水冲洗。在1小时之后,抽滤的水呈中性,但仍然含有氯离子。经过4小时不断的冲洗才使得抽滤液中基本不含氯离子。晾干一周后,在110℃烘箱中活化2小时。

第二、活化后的硅胶加石油醚浸泡并搅拌均匀。在装柱时,宜使用口径较大的玻璃漏斗置于层析柱上部,注入1/2高的石油醚,打开下部活塞,然后尽量均匀地将硅胶倾入漏斗,这样可以防止层析柱中形成断层(这一步是实验的关键步骤)。

3、柱层析过程中得到了二个显色带,第一个带显橙黄色,第二个带显淡黄色。从加入洗脱剂到收集完第一个显色带耗时90分钟,使用洗脱剂(石油醚/乙酸乙脂=2/1V/V)120ml,收集到约50ml。然后加入95%的乙醇进行洗脱,耗时30分钟收集到了第二个显色带,约有30ml。由实验可知以极性大的洗脱剂洗脱速度较快,而且收集的显色带较集中。如果在层析柱中有气泡或断层将影响分离效果,造成显色带较宽。

六、谱图分析

1、实验所得第一个显色带为α—胡萝卜素

参考数据为:α—胡萝卜素473(134896),444(147911),422(104713)

实验数据为:473.20(119490),445.47(137330),425.84(110090)

2、实验所得第二个显色带呈淡黄色,做旋光分析发现起具有较小的旋光度,可能是β-胡萝卜素。

  

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