肌酸激酶同工酶CK-MB 肌酸激酶mb同工酶

如何认识肌酸激酶同工酶CK-MB？

肌酸激酶同工酶有三种，即CK-MB、CK-BB和CK-MM。其中CK-BB主要存在于大脑、肾、前列腺及子宫组织；CK-MM主要存在于骨骼肌、心肌；而CK-MB则主要存在于心肌。虽然血清肌酸激酶（CK）是诊断心肌梗死的一个极其灵敏的指标，但其对于心肌损害诊断的特异性不及CK-MB。急性心肌梗死发作在胸痛出现后3小时左右即开始增高，16-24小时达最高峰，72小时后恢复正常。临床及时测定CK-MB诊断心肌梗死的灵敏度基本为100%。CK-MB的检测结果以国际单位/升（IU/L）表示。

血清肌酸激酶同工酶CK-MB正常参考值是多少？

酶连续监测法CK-MB <25IU/L

CK-MB作为AMI诊断依据时应大于正常上限值的2倍.

血清肌酸激酶同工酶CK-MB异常有何临床意义?

CK-MB活性增高是心肌损害的特异性指标,对心肌梗死早期诊断很有价值.同时,CK-MB早达峰值者比晚达峰值者预后要好。

肌酸激酶同工酶CK-MB检测时应该注意什么？

无需空腹，采不抗凝静脉血，分离血清进行测定，避免溶血。

肌酸激酶测定

酶偶联测定法

1.原理

CK催化磷酸肌酸(CrP)与二磷酸腺苷(ADP)反应产生三磷酸腺苷(ATP)与肌酸(Cr)；偶联已糖激酶(HK)及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)的催化反应。HK催化葡萄糖(Glu)与ATP反应，形成葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)，G-6-PD催

2.试剂

3.操作

具体操作根据各医院分析仪类型及试剂说明书而定

(1)吸2mL应用试剂I入测定管中，加100μL血清。混合，放人37℃水浴至少5min。

(2)在37℃水浴中预温应用试剂Ⅱ至少5min。

(3)加入200μL应用试剂Ⅱ，混合，转入3mL比色杯(10mm光径)，立即放入恒温比色槽内。

(4)待120s的延迟期后，用340nm波长连续记录吸光度的改变，用反应速率曲线的线性部分计算CK活力。

4.计算

CK （U/L）=△A/ min× ×

=△A/ min×3698

2.30：反应液的总体积(mL)

0.10：血清用量(mL)

6220：NADPH在340nm的摩尔吸光度

△A/ min：平均每分钟的吸光度变化值

5.参考值范围

成年男性参考值上限为180U/L(37℃)，女性为130 U/L(37℃)。

6.注意事项

(1)本法线性至少达3000U/L，更高活力的血清用已知CK活性正常的血清稀释后再测。

(2)中华医学会检验学会酶学小组推荐酶催化反应温度均为37℃，文献报道CK测定以30℃为好。

(3)试剂空白的速率(△A／min)应小于0.001，即小于3.7 U/L。

(4)EDTA可防止NAC由于二价离子催化发生的氧化，有利于试剂的稳定。

(5)血清Ca2+是Mg2+的竞争性抑制剂。加入2mmol／L的EDTA可消除Ca2+的影响：Mg2+为10mmol／L时，虽与EDTA结合，但不影响对CK的激活。血清中存有内源性的抑制剂，表观CK活力随血清稀释倍数增加而增加，故不宜用盐水稀释。

(6)红细胞及几乎所有组织中含有腺苷酸激酶(AK)，催化下列反应：

2ADP———>ATP+AMP

反应中产生的ATP导致表观CK活力增加。氟化物、AMP及AP5A抑制AK活性。氟离子可与镁离子形成不溶性的MgF2，故不宜用氟化物为抑制剂。AMP是AK的竞争性抑制剂，引起AK催化反应的产物抑制。AP5A竞争性地抑制肌肉及红细胞的AK，对肝及肾的AK很少抑制。5mmol/LAMP与10μmol/L AP5A合用，能有效地抑制红细胞及肝的AK。

(7)CK活性不稳定，血清保存时易丧失。保存的血清标本中不需加巯基试剂，反应液中含的EDTA及NAC可使4℃保存1周的血清CK重新激活达99％。

(8)红细胞不含CK，轻度溶血无影响。中度及重度溶血时，因红细胞释出的AK、ATP及G6P影响延迟相及产生副反应。

五、CK同工酶的测定

(一) 标本采集、处理和贮存

CK同工酶检测血清和血浆均可。在4℃可保存数天，-15℃可保存2周，若用血浆宜用EGTA，而不用EDTA抗凝。冷冻血浆测定时，应在30℃以下融化，需反复冰融者应加还原剂——巯基乙醇以稳定酶活性，速冻及贮存于-20℃或-70℃，在有β-巯基乙醇和EGTA存在时，MM和MB可稳定数年，而BB则仅稳定半年。由于CK同工酶半衰期短，故酶活性的高低受标本采集时间的影响较大。

琼脂糖凝胶电泳法

1.原理

CK分子是由M和B两种亚单位组成的二聚体，在电泳条件下，CK-BB迁移最快，CK-MB居中，CK-MM最慢。电泳后进行酶促反应显色，观察结果。显色原理是：CK催化磷酸肌酸(CrP)及ADP，产生肌酸(Cr)及ATP，在偶联的HK催化下葡萄糖被ATP磷酸化，形成G-6-P；在偶联的G-6-PD催化下G-6-P被NADP+氧化，形成6-P-G，同时NADP+还原为NADPH。在365nm观察NADPH的荧光或用荧光光密度计扫描定量。也可用四氮唑盐显色法，即利用酚嗪二甲酯硫酸盐(PMS)将NADPH的氢传递给氯化碘代硝基四唑(INT)，使其还原成紫红色的甲鐟，显示CK同工酶区带。

2.试剂

3.操作

(1)隔水煮沸溶解试剂“③”，取1.5mL铺于1～1.2mm厚的载玻片上。于近阴极端并行挖两个槽，作两份标本，或作标本与控制物。

(2)加样5μL，80V电泳50min。

(3)合理安排配制混合底物显色液的时间，使配制完成时电泳结束。

(4)将电泳凝胶板置涂以黑漆的铝盒中，吸底物显色液1.5mL铺于凝胶板上，加盖，待凝后置37℃水浴1小时。

(5)置固定液(乙醇：醋酸：水＝150:10:40)中2～4小时，转入蒸馏水中数小时，取出观察结果或用光密度计在500nm波长下扫描定量。需要时可平推至空白卡片纸上，37℃孵箱过夜，干片保存。或用无PMS、INT底物显色液，37℃水箱孵育20min。

(6)再置60℃干燥箱中20min,在紫外灯(365nm)下观察荧光。有条件者用荧光光密度计扫描定量，激发波长

4.结果观察

琼脂糖凝胶电泳法的结果观察如图9-14所示。

5.注意事项

广泛存在于各种组织的腺苷酸激酶(AK)催化ADP产生ATP，干扰同工酶结果的判断。加入AMP可抑制此反应，但过量AMP也抑制CK。NaF抑制AK，不抑制CK，与AMP合用可抑制各种AK同工酶的97％。NaF与CK激活剂Mg2+可逐渐形成MgF2沉淀，所以，NaF与Mg2+分开配制，临时混合，不影响各自的作用。电泳需较高pH，酶反应需较低pH，本法中用低离子强度，pH低于8.6的电泳缓冲液；高离子强度，pH低于6.7的基质缓冲液。当含琼脂糖的基质显色剂覆盖于电泳后的凝胶板，上下凝胶中的成分相互扩散后的pH，恰为酶作用的最适pH。Bis-Tris全名为Bis(2-羟乙基)亚氨基-Tris(羟甲基)甲烷，25℃时pKa＝6.46，是CK同工酶。测定优选的缓冲剂，200mmol/L时，CK活力最大。如无Bis-Tris；亦可用咪唑加EDTA作基质缓冲液。EDTA作Ca2+的络合剂，因Ca2+抑制CK活力。血清CK活力随温度升高而增加，直至45℃；更高温度迅速下降，56℃时很快失活。琼脂糖电泳法测CK同工酶，绝不能象作LDH同工酶用温度较高的琼脂糖基质显色液，否则CK活力丧失。而非脱氢酶反应(Nothingdehydogenase，NDH)显著。NDH是相当于白蛋白及β球蛋白区带处的紫红色区带，与蛋白质的巯基有关，标本用量大，pH高时尤其明显，仅四唑盐及PMS就可与标本产生，用测NADPH荧光法可避免。本法中标本用量少，显色时pH较低，NDH反应不明显。CK是巯基酶，绝对需要巯基试剂活化。但巯基试剂可还原四唑盐，N-乙酰半胱氨酸及谷胱甘肽还原四唑盐能力弱，可使背景清晰。PVP是隋性聚合体，作为酶扩散的障碍物加入，可改善区带分离效果。CK不稳定，对光、热及高pH敏感，最好将及时分出的血清充C02后塞紧管口，置冰室或-30℃保存，至少可稳定半个月，及时测定更好。不主张加巯基活化剂保存。影响CK同工酶电泳与显色的因素很多，必须同时作控制物。

控制物制备方法：取小白鼠心、股四头肌、脑，分别在pH7.2缓冲液(50mmol／LTris-HCl，250mmol／L蔗糖，10mmol/LEDTA，10mmol／L还原型谷胱甘肽)中匀浆，10000g离心l5分钟。取上清液，测CK活力。再用此pH7.2缓冲液稀释到200U／L左右，分装后置-30℃保存。用前取出置室温融化后将三种组织的控制物等量混合使用(可节省基质)。如冻干，用前以正常人血清重建并混合，除CK-MM、CK-MB及CK-BB外，在CK-MM与CK-MB之间出现一条带，是CK-Ig的复合物，称大CK1型。

六、临床应用

CK及其同工酶是目前世界上临床测定次数最多的酶，80年代初期统计分别达一亿次和一千万次。这是因为CK在骨骼肌、心肌和脑疾患时常明显升高，如同时测定同工酶还有助于疾病的鉴别诊断。表9－1是各种疾病时总CK和CK同工酶的变化。

这里酶的测定主要用于早期诊断AMI和判断溶栓治疗的疗效以及判断疾病预后，特别在无Q波型AMI，此时心电图无Q波变化，常需其它检查来协助临床医师诊断和鉴别诊断AMI。目前有些国外学者认为在诊断AMI不需要同时作许多酶，只要单测CK一项即可。这是因为：

1.心肌细胞含有大量CK：按每克组织含酶量计算，CK超过天冬氨酸转氨酶(AST，即谷草转氨酶)和乳酸脱氢酶(LD)等。所以当发生AMI、心肌细胞坏死时，释放出来的CK量超过其它酶。

2.CK由于分子量不大，而且大量存在于胞质中，所以在各种酶中最早进入血液：一般在AMI后4～8小时就可能超过参考值上限。LD由于分子量大(约为125000)，故增高明显迟于其它酶。同样线粒体中的酶，如线粒体AST在血中浓度升高明显推迟。

3.由于CK主要存在于肌肉组织中，其它脏器如肝、肾、血细胞中含量极微：在诊断AMI时，其特异性远比一般代谢酶如LD、AST等为高，特别是溶血标本对CK测定结果影响较小。近年来国内广泛使用动态法测定酶活性，大大提高了CK测定的准确性和重复性，并且可以在很短时间(约5分钟)测定完毕，特别适合于急诊患者。但CK测定的局限性也很明显，由于CK大量存在于3种肌肉组织中，尤其是骨骼肌中CK含量不论按浓度含量或按全身总量计算都大大超过心肌。因此骨骼肌局部或全身疾病都很容易引起血中总CK活性升高。血CK的极度增高主要见于全身疾病。曾有一例横纹肌溶解症患者，血中CK含量高达100000U/L，而在AMI时，就是大面积梗死，血中CK含量也很少超过3000U/L。肌注某些药物也可能引起，CK一过性升高，但一般不超过正常上限值的2倍，持续时间不超过1天。因此国外有些医院将CK参考值上限的2倍作为诊断AMI的判断值，以减少假阳性：尽管CK测定诊断AMI的灵敏度很高，但特异性却明显偏低，其假阳性率达15％～30％；CK在体内的半寿期明显比其它酶短，心肌组织一次梗死后，CK急剧升高并很快恢复正常(48～72小时)，这样在亚急性心肌梗死时CK可能正常，但其它酶如AST，特别是LD很可能居高不下。

以往对于CK诊断AMI常强调下列几点：1.AMI发病后8小时内查血CK不高，不应轻易除外AMI诊断，并以此结果作为基础值，和以后测定值作比较，任何怀疑AMI者应尽早抽血送检；2.发病后24小时CK测定结果临床意义最大，因为此时正当CK的峰值时间，如不超过正常值上限可排除AMI诊断；3.发病后48小时内应多次测CK活性，如不出现一个典型升高和下降的过程，应怀疑AMI的诊断。

近年文献指出，某些AMI患者血中CK可以不超过正常值，特别是不超过参考值上限的2倍，这些病例多见于无Q波心肌梗死。长期以来认为CK峰值高低对AMI预后判断有一定价值。CK-MB由于大量存在于心肌组织中，其他组织和器官中含量很少，所以CK-MB是目前诊断AMI的一个极其可靠的生化指标，特异性可达95%乃至更高。一般认为其敏感度比CK总活性稍差，但也有文献报道，约有12.5%AMI患者总CK不高，但CK-MB超过正常。AMI不同时期CK同工酶电泳图谱变化如图9－15所示。

CK-MB测定方法和试剂盒很多，同一标本在不同实验室往往结果不同。从测定原理来分，可分为测酶活性与酶质量两大类方法。第一类方法先用物理、化学和免疫等各种手段将CK－MB和其它同工酶分开，然后根据酶的催化活性测CK-MB浓度，用活性单位/升(U/L)或百分比报告结果。测酶质量方法则是利用CK-MB的抗原性，根据抗原抗体反应测CK—MB酶蛋白浓度，单位为μg/L。两者结果有时不一致，因为如酶变性失活但仍保留抗原性，此时用测酶活性的方法结果不高，但用测质量方法可以增高。80年代早期德国学者根据此结果认为AMI患者血中存在着灭活的CK。但最近用改进方法测CK-MB，发现两法差异不大。国内普遍使用测酶活性方法，目前较多使用电泳方法分离CK-MB。电泳法特点是准确可靠，当出现一些异常同工酶如巨CKⅠ、巨CKⅡ等，从电泳图谱上很容易发现，并可通过光密度计进行定量测定，不会将CK-BB和各种异常同工酶误认为是CK-MB而误诊。其主要缺点是灵敏度较差。

近年来国内一些单位用免疫抑制法测CK-MB，其原理为抗M亚单位的抗血清可以和CK-MM及CK-MB中的M亚单位形成抗原抗体复合物，从而完全抑制M亚单位的酶活性，因为正常血清中几乎无CK-BB，故将此值乘以2可以认为大致代表CK-MB的活性。此法简单迅速，缺点是特异性差，如患者血清中还存在着CK-BB或者异常CK时，都将出现假阳性。故可作为过筛试验，如有疑问时用电泳法核实。另外此法正常值明显高于其它方法。如Sclavo公司试剂盒的正常值为18U/L，而电泳等其它方法都是<5U/L。有人认为这是因为CK-MM还可以进一步分为若干亚型，一般抗MM血清对MM3抑制较好，但对MM1抑制较差，而正常情况下血中MM亚型的存在以MMl为主，故导致正常值明显偏高。AMI第一天血中以MM3为主，但第二天以后则以MMl为主，因此使用此类方法诊断AMI和解释结果时应谨慎。

国外从20世纪80年代初建立了多种测CK-MB酶质量的方法。应用最多的是美国Hybriteeh公司的ELISA方法，正常人在5μg/L以下，此法结果和电泳法相关良好。缺点是测定时间长达半天，只适合成批标本。近两年来应用单克隆技术制备出特异性极高的只和CK-MB作用的抗血清，已有多种试剂盒供应。最近Deerson以CK-MB≥10μg/L以及CK-MB指数≥3.0(μg/UCK×l00)为AMI诊断标准。CK-MB单克隆抗体方法简单，特异性高，是目前重点发展的方法，近来有人认为此法有助于不稳定型心绞痛的诊断；可惜国内应用不多。

CK-MB的局限性在于骨骼肌损伤时也可能释放出一定量的CK-MB。虽一般认为骨骼肌含有的CK-MB在总CK中不超过5％，但也有例外。Evans报道1例横纹肌肉瘤的CK-MB高达274U/L，占总CK的28％。因此当CK-MB增高时，临床也应考虑有无非心肌来源的可能性。

骨骼肌中有大量CK，所以CK明显升高(3000U/L)大都见于肌肉疾病。此时CK测定用于鉴别肌萎缩病因，如Duchenne型和Becker型肌萎缩患者，常在临床前期血中CK就可中度和高度增加。该病是伴性遗传，在75％女性Duchenne型肌萎缩携带者和50％女性Becker型肌萎缩携带者血中也可查到CK升高。此外各种原因(病毒，细菌和寄生虫)引起的肌肉感染性疾病都能引起CK升高。但由于神经疾病引起的肌萎缩症，CK常不增高。

脑中虽含有较大量CK，脑血管意外时有大量CK释放入组织间隙，但由于血脑屏障存在，只能在部分病例中查到血中和脑脊液中CK升高，以及出现CK-BB，但阳性率不高，这妨碍了CK在这方面的临床应用。

人胚胎期主要为CK-BB，有人根据“癌胚”理论，提出CK-BB可作为肿瘤标记物，可惜的是阳性率不高，只占恶性肿瘤10％左右。