质粒小量抽提 质粒抽提原理

质粒(Plasmid):独立于染色体外的,能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中,在细菌细胞中最多。
质粒小量抽提 质粒抽提原理




蓝白斑筛选:
现在常用的质粒载体上都带有β-半乳糖激酶(LacZ)基因。载体上重组DNA的插入位点存在于特定遗传标记内部,外源DNA片段的插入会导致该遗传标记失活。本实验使用的载体含一个大肠杆菌DNA的小片段,其中含乳糖操纵子的启动子和β-半乳糖激酶基因,多克隆位点位于其编码区内。载体与编码β-半乳糖激酶C端的部分序列的宿主之间发生互补——α-互补,产生完整的β-半乳糖激酶活性的Lac+细菌。它们在生色底物存在下形成蓝色菌落。当外源DNA插入多克隆位点时,细菌不能产生β-半乳糖激酶,即使有生色底物存在,一般也会产生白色菌落。而无插入片段的重组细胞菌落将产生蓝色菌落。X-gal和IPTG是被用于鉴别蓝白菌落的底物,常涂布于固体培养基上。

质粒提取方法:
细菌的收获可通过离心来进行,而细菌的裂解可采用多种方法。这些方法包括用非离子型或离子型去垢剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于3个因素:质粒的大小、大肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。在实际操作中,可根据所使用的宿主菌及质粒的特性来选择合适的方法。本实验所介绍的碱裂解法提取质粒的方法是一种简便、快捷、效率高、消耗少的方法,适合于小量及大量、质粒的提取。其原理是用EDTA和SDS破坏细胞壁和细胞膜,使质粒DNA分子,多聚核糖体及其他可溶物质从细胞中逐步释放,而染色体DNA分子与细胞碎片缠绕在一起,可经离心与质粒DNA分开。

质粒电泳:
质粒电泳一般采用琼脂糖凝胶电泳。电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便、快速,可以分辨用其他方法所无法分离的DNA片段。此外,直接用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭进行染色,可确定DNA在凝胶中的位置。少至1-10ng的DNA条带即可直接在紫外灯下检出。电泳后的DNA条带还可以从凝胶中回收,用于克隆操作。

影响DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率的因素有:

1)DNA分子的大小;2)DNA的构象;3)琼脂糖浓度;4)所用电压;5)碱基组成及电泳温度;6)电泳缓冲液的组成。

质粒提取的实验步骤(详见generay质抽试剂盒说明书)

1. 取1~2ml过夜培养的菌液,12000rpm离心1min,弃尽上清。

注意:对于低拷贝数的质粒,请用4~6ml菌液,通过多次离心将菌体收集到一个离心管中。

2. 加入200μl SolutionⅠ,用枪头或振荡器充分悬浮细菌。

注意:* 确认Solution I中已加入RnaseA.

* 不要残留细小菌块,否则会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。

3. 加入200μl SolutionⅡ,立即温和并充分地上下翻转混合4~6次,使菌体充分裂解,直至形成透亮的蛋清状溶液,此步骤不宜超过5min。

注意:* SolutionII使用后立即盖紧瓶盖,以免空气中的CO2中和SolutionII中的NaOH发生中和反应,降低溶菌效率。

* 避免剧烈摇晃,否则将导致基因组DNA的污染。

4. 加入350μlSolutionⅢ,温和并充分地上下翻转混合8~10次,室温放置2~5min。12,000rpm,离心10min。

注意:避免剧烈摇晃,否则将导致基因组DNA的污染。

5. 将步骤4中的上清转移到套放于2ml收集管内的GenCleanColumn中,室温6000rpm 离心1min,取出GenCleanColumn,倒掉收集管中废液。

注意:忌取到沉淀,否则会出现基因组DNA和蛋白质污染。

6. 将GenClean Column重新放回收集管中,加入500μl SolutionIV,12,000rpm,室温离心1min,倒掉收集管中废液。

7. 将GenClean Column重新放回收集管中,加入500μl WashSolution,12,000rpm,室温离心1min,倒掉收集管中废液。

8. 重复步骤7一次。

9. 倒掉收集管中废液,12,000 rpm,室温离心1min,彻底去除WashSolution。

注意:此步骤高速空离是为了去尽残留的乙醇,请勿省略,否则可能因所纯化的核酸中残留有乙醇而影响后续的实验效果。将GenClean柱室温开盖放置10min或50℃放置5min,将有助于彻底去除WashSolution中的乙醇。

10. 将GenClean Column放入干净的1.5ml离心管中,在GenCleanColumn膜中央加入50μl~70μl ElutionBuffer,37℃放置2min。12,000rpm,室温离心1min,离心管中的液体即为包含目的质粒的溶液,取2~5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测,纯化好的DNA可立即用于后续实验或-20℃冻存。

注意:将Elution Buffer或去离子水加热至65℃将提高洗脱效率。

质粒检测:

1. 制备凝胶
称1g琼脂糖,放入250 mL三角瓶内,加入100 mL1×TAE电泳缓冲液,加热煮沸等其凉到60℃左右,倒入封好的电泳板上。
2. 上样
1)吸取2 μL质粒,加入1μL上样缓冲液(Loading buffer),混匀。
2)将质粒样品点入到琼脂糖凝胶的上样孔中
3. 电泳
连接好电泳槽和电泳仪,以5V/cm恒压电泳。
4. 染色及脱色
电泳1.5-2 h后,关上电泳仪。取出凝胶,放入染色槽内,加入1滴溴化乙锭(EB)轻轻摇荡15分钟。将染色液倒入储存桶内,在染色槽内加入自来水,轻轻摇荡10分钟。
5. 结果观察
将凝胶放到紫外灯下观测。记录观察到的电泳条带

实验结果与分析


质粒沉淀离心后,在管底能见到少量白色物质。
真空干燥后,无色,贴于管壁。
加ddH2O或TE能迅速溶解。
电泳凝胶上呈现一条亮带。
如果质粒提取中降解,则会出现上下三条带,分别代表超螺旋、带切口和带切刻的质粒。
溶解时不加RNase,则下部会有很亮的一片,为小分子RNA片段。
质粒中含太多杂质,则干燥后会呈白色或褐色,不易溶解。

常见问题分析

1.纯化质粒DNA时,一般使用多少菌体培养液比较合适?

根据我们的经验,如为高拷贝质粒(如:pUC18等),使用2ml培养液与4ml培养液纯化的质粒DNA的收量差别不是很大,可以纯化得到10~15μg的高纯度质粒DNA。我们一般使用2ml的菌体培养液进行质粒DNA提取。

2.本试剂盒对低拷贝质粒的纯化提取情况如何?

针对低拷贝质粒时,使用4ml的菌体培养液进行质粒DNA的提取比较合适。如使用pBI121质粒时,在4ml的菌体培养液中,可以纯化提取2~3μg的高纯度质粒DNA。

3.为什么质粒DNA的收量较低?

一般情况下,从2ml的LB培养基进行过夜培养的pUC18/JM109培养液中,可以纯化得到约10~15μg的高纯度质粒DNA。质粒DNA收量较低时,可以从以下几个方面考虑:

(1)大肠杆菌太陈旧(在低温下的长期保存菌等)。请涂布平板培养后,重新挑选新菌落进行液体培养。

(2)质粒拷贝数低。使用低拷贝数载体时,每次产出的质粒DNA量会降低。

(3)确认操作过程的严密性。应严格按操作方法进行操作。

4.为什么加入Solution II后的溶菌液不澄清?

(1)菌体量过多,不能充分溶菌。使用本试剂盒时,每次可处理的菌体培养液为1-2 ml。

(2)菌体沉淀悬浮不充分。在加入SolutionI后,应使用振荡器(Vortex)等进行剧烈振荡使菌体沉淀充分悬浮后再做溶菌处理。

5.为什么质粒DNA测序结果不佳?

(1)模板DNA定量不准。请对质粒DNA正确定量。使用吸光度值定量时,有时DNA溶液中的不纯物会影响吸光度值的测定,此时建议使用琼脂糖凝胶电泳法进行定量。

(2)质粒DNA纯度不好。请严格遵守实验操作要求,使用新鲜菌体培养液提取质粒。

(3)洗脱液中盐离子浓度过高。建议进行DNA洗脱时用灭菌蒸馏水洗脱。

(4)DNA插入片段本身立体结构复杂。有些DNA立体结构复杂(如GC rich、重复序列等)时难以测序,应改进测序方法。

  

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