爱华网复制叉的形成则是由多种蛋白质及酶参与的较复杂的复制过程。在DNA不连续复制过程中，结合于复制叉前面，在起始点处解开双链，反应是在解链酶的催化下进行的。解链酶有ATP酶活性的酶，两种活性相互偶联，通过水解ATP提供解链的能量。解链酶的作用就是打开DNA双链之间的氢键。
解链酶分解ATP的活性依赖于单链DNA的存在。如果双链DNA中有单链末端或切口，则DNA解链酶可以首先结合在这一部分，然后逐步向双链方向移动。复制时，大部分DNA解旋酶可沿滞后模板的5’—〉3’方向并随着复制叉的前进而移动，只有个别解旋酶（Rep蛋白）是沿着3’—〉5’方向移动的。故推测Rep蛋白和特定DNA解链酶是分别在DNA的两条母链上协同作用以解开双链DNA。
大肠杆菌中DnaB蛋白就有解链酶活性，与随从链的模板DNA结合，沿5′→3′方向移动，还有一种叫做Rep蛋白和前导链的模板DNA结合沿3′→5′方向移动。
2.单链结合蛋白(single strand bindingproteins,SSBP)
ssbDNA蛋白是较牢固的结合在单链DNA上的蛋白质。原核生物ssbDNA蛋白与DNA结合时表现出协同效应：若第1个ssbDNA蛋白结合到DNA上去能力为1，第2个的结合能力可高达103；真核生物细胞中的ssbDNA蛋白与单链DNA结合时则不表现上述效应。ssbDNA蛋白的作用是保证解旋酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构，它以四聚体的形式存在于复制叉处，待单链复制后才脱下来，重新循环。所以，ssbDNA蛋白只保持单链的存在，不起解旋作用。ssbDNA蛋白稳定解开的单链，保证此局部不会恢复成双链。它与解开的单链DNA结合，使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切酶对单链DNA的水解，保证了单链DNA做为模板时的伸展状态，SSBP可以重复利用(图)。
SSBP与DNA单链结合，既防止核酸水解酶的作用，又避免解开的单链DNA重新缔合形成双链，从而保持一种伸展状态，以保证复制顺利进行。在E.coli中SSB为四聚体，对单链DNA有很高的亲和性，但对双链DNA和RNA没有亲和力。它们与DNA结合时有协同作用。
图 大肠杆菌DNA复制叉中复制过程简图
3、DNA旋转酶(DNA gyrase)是一个由两个GraA和两个GraB亚基构成的四聚体蛋白，DNA旋转酶以其可以利用ATP结合和水解的能量来介导负超螺旋到松弛的共价闭合DNA而闻名于所有拓扑异构酶。 它是DNA拓扑异构酶Ⅱ中的一种亚类，其主要功能为引入负超螺旋，在DNA复制中起十分重要的作用。迄今为止，只有在原核生物中才发现DNA旋转酶。 作用机理：DNA复制时解链产生正螺旋，阻碍复制体的前进，DNA旋转酶通过引起瞬间DNA双链的断裂和重新连接，以改变DNA的拓扑状态，引入负超螺旋。
4.引发体的形成：
DNA复制起始的关健步骤是前导链DNA的合成，一旦前导链DNA的聚合作用开始，随从链DNA的合成也随着开始。由于前导链的合成是连续进行的，所以它的起始相对简单，而随从链的合成是不连续进行的，所以引发阶段比较复杂。大肠杆菌的引发前体由DnaB. Dna C和单链结合蛋白组成。
(1)引物酶(primase)
它是一种特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。这种短RNA片段一般十几个至数十个核苷酸不等，它们在DNA复制起始处做为引物。RNA引物的3′桹H末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一个磷酸二酯键的位置。
催化RNA引物合成的酶叫引发酶（primerase）。引发酶识别DNA单链模板特异序列，以核糖核苷三磷酸为底物合成寡聚核苷酸，产生3′-OH，为DNA聚合酶起始磷酸二酯键提供条件。
引物与典型的RNA不同，他们在合成以后并不与模板分离，而是以氢键与模板结合。
实验表明，在细菌中，前导链的引物和滞后链中前体片断的引物在合成时需要不同的条件。滞后链前体片断引物的合成是由引发酶催化的，而引发酶对利福平（rifampicin）不敏感，因此不受利福平抑制；前导链引物的合成是由RNA聚合酶催化的，而RNA聚合酶对利福平十分敏感，所以受利福平强烈抑制。
(2)引发体(primosome)
高度解链的模板DNA与多种蛋白质因子形成的引发前体促进引物酶结合上来，共同形成引发体，引发体主要在DNA随从链上开始，它连续地与引物酶结合并解离，从而在不同部位引导引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3′桹H末端接下去合成DNA片段，这就是随从链不连续合成的开始。
5、DNA聚合酶
1）DNA聚合酶I
DNA聚合酶I最初由Kornberg于1955年在大肠杆菌中发现的，纯化的酶是一条相对分子量为109KD的多肽链。
用枯草杆菌蛋白酶处理可以将DNA聚合酶I水解为一大一小两个片段。较大的C末端片断分子量为68KD，叫klenow片断，常用做体外合成DNA的工具酶；具有5′→3′的聚合酶活性，可以将脱氧核苷三磷酸加到DNA链的3′-OH上，形成3′，5′-磷酸二酯键，这个活性需要DNA模板和引物的存在。klenow片断还具有3′→5′的外切酶活性，可以从3′端将DNA链水解。当正确的核苷三磷酸进入正在合成的链的末端，酶就向前移动，一旦发生错误，酶就退回，将错误的碱基切除，这是一种校对（proofreading）功能。
较小的N末端片断分子量为35 KD，具有5′→3′的外切酶活性，在体内功能是切除小的DNA片断，包括切除RNA引物。
尽管DNA聚合酶I活性很高，但它们的主要功能是用于修复体内DNA双螺旋区中的单链区，这些单链区是在DNA复制时或DNA受损伤后留下的。DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性从5′端切除DNA受损伤的部位，DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶活性随即开始工作，使DNA链向3′端延伸，这称为切口平移（nicktranslation）。
在DNA复制中，RNA引物的切除实际上就是切口平移；DNA的损伤修复中也存在切口平移。在体外，可以用切口平移来制备高放射性活性的DNA探针。
2）DNA聚合酶Ⅲ
DNA聚合酶Ⅲ全酶以异源复合体发挥功能。α亚基、ε亚基和θ亚基相连组成核心酶（coreenzyme），每种亚基两个，形成两个催化合成DNA的活性中心。α亚基具有5′→3′的聚合酶活性，并具有5′→3′的外切酶活性；ε亚基具有3′→5′的外切酶活性，这对校正功能十分重要。核心酶在τ亚基存在下，形成二聚体。其他亚基的添加促进二聚化和增强了酶活性（τ亚基起着促使核心酶二聚化的作用）。
DNA聚合酶Ⅲ具有持续合成能力，β亚基在二聚体形成中发挥重要的作用。
β亚基的功能犹如夹子、两个β亚基夹住DNA分子并可以向前滑动，使聚合酶在完成复制前不再脱离DNA，从而提高了酶的持续合成能力（通过它形成一个环使DNA聚合酶Ⅲ的核心酶附着在DNA模板上，并可以沿单链DNA滑动而使DNA的复制过程程序化）。β亚基的定位能防止核心酶在DNA复制过程中从模板上掉下来，如果没有β亚基，核心酶只能合成大约20个核苷酸就要脱离模板。
除了β亚基以外，γ亚基是一种依赖于DNA的ATP酶，两个γ亚基与另4个亚基（δ亚基、δ′亚基、χ亚基、ψ亚基）构成γ复合物，其主要功能时帮助β亚基夹住DNA，故称夹子装置器（clamploader）。β亚基在DNA上定位和解离都需要γ复合物介导。完整全酶为不对称二聚体结构。当聚合酶遇到逆向模板上前面合成的冈崎片断时，γ复合物的存在允许β亚基从模板上解离。这样当核心酶合成了冈崎片断，将从后滞链的全酶中释放出来，与下一个由DNA引发酶提供的模板引物的起始前复合物结合。
在半不连续复制过程重，同一个DNA聚合酶Ⅲ分子可以同时合成前导链和滞后链。更确切地讲，在前导链和滞后链的生长点，核苷酸的增加同时进行。如前所述，DNA聚合酶Ⅲ有两个DNA合成催化中心，很可能前导链和滞后链各利用一个催化中心合成DNA。滞后链的模板链围绕一个催化中心折叠成环状结构，使滞后链的方向颠倒(生化方向不变)。
6、DNA连接酶
DNA连接酶催化双股链内相邻单链切口的3′-OH与5′- P酰基形成磷酸酯键。
酶的活化? NAD+或ATP中的腺苷酰基（AMP）与酶活性中心的赖氨酸残基的ε-NH2以磷酰胺键结合，形成共价中间体酶-AMP；
腺苷酰化DNA? 酶-AMP将腺苷酰基（AMP）转移给DNA切口处的5′磷酰基团，以焦磷酸的形式活化，形成AMP-P-DNA。
亲核攻击完成DNA连接?通过相邻DNA的3′-OH对活化的P原子进行亲核攻击，生成3′，5′-磷酸二酯键，同时释放出AMP。
二、DNA复制过程真核、原核的复制大致可以分为复制的引发，DNA链的延伸和DNA复制的终止三个阶段。
(一)DNA复制的引发
复制的引发(Priming)阶段包括DNA复制起点双链解开，通过转录激活步骤合成RNA分子，RNA引物的合成，DNA聚合酶将第一个脱氧核苷酸加到引物RNA的3'-OH末端。
复制引发的关键步骤就是前导链DNA的合成，一旦前导链DNA的聚合作用开始，滞后链上的DNA合成也随着开始，在所有前导链开始聚合之前有一必需的步骤就是由RNA聚合酶(不是引物酶)沿滞后链模板转录一短的RNA分子。在有些DNA复制中，(如质粒ColE)，该RNA分子经过加式成为DNA复制的引物。但是，在大部分DNA复制中，该RNA分子没有引物作用。它的作用似乎只是分开两条DNA链，暴露出某些特定序列以便引发体与之结合，在前导链模板DNA上开始合成RNA引物，这个过程称为转录激活(transcriptional activation)，在前导链的复制引发过程中还需要其他一些蛋白质，如大肠杆菌的dnaA蛋白。这两种蛋白质可以和复制起点处DNA上高度保守的4个9bp长的序列结合，其具体功能尚不清楚。可能是这些蛋白质与DNA复制起点结合后能促进DNA聚合酶Ⅲ复合体的七种蛋白质在复制起点处装配成有功能的全酶。DNA复制开始时，DNA螺旋酶首先在复制起点处将双链DNA解开，通过转录激活合成的RNA分子也起分离两条DNA链的作用，然后单链DNA结合蛋白质结合在被解开的链上。由复制因子X(n蛋白)，复制因子Y(n'蛋白)，n"蛋白，i蛋白，dnaB蛋白和dnaC蛋白等6种蛋白质组成的引发前体(preprimosome)，在单链DNA结合蛋白的作用下与单链DNA结合生成中间物，这是一种前引发过程。引发前体进一步与引物酶(primase)组装成引发体(primosome)。引发体可以在单链DNA上移动，在dnaB亚基的作用下识别DNA复制起点位置。首先在前导链上由引物酶催化合成一段RNA引物，然后，引发体在滞后链上沿5'→3'方向不停的移动(这是一种相对移动，也可能是滞后链模板在移动，见后)，在一定距离上反复合成RNA引物供DNA聚合酶Ⅲ合成冈崎片段使用，引发体中许多蛋白因子的功能尚不清楚。但是，这些成份必须协同工作才能使引发体在滞后链上移动，识别合适的引物合成位置，并将核苷酸在引发位置上聚合成RNA引物。由于引发体在滞后链模板上的移动方向与其合成引物的方向相反，所以在滞后链上所合成的RNA引物非常短，一般只有3-5个核苷酸长。而且，在同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列，表明引物酶要在DNA滞后链模板上比较特定的位置(序列)上才能合成RNA引物。为什么需要有RNA引物来引发DNA复制呢?这可能尽量减少DNA复制起始处的突变有关。DNA复制开始处的几个核苷酸最容易出现差错，因此，用RNA引物即使出现差错最后也要被DNA聚合酶Ⅰ切除，提高了DNA复制的准确性。RNA引物形成后，由DNA聚合酶Ⅲ催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加在RNA引物3'-OH端而进入DNA链的延伸阶段。
(二)DNA链的延伸
以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链为3’—〉5’走向，在其上DNA能以5’—〉3’方向连续合成，称为前导链(leadingstrand)；另一条模板链为5’—〉3’走向，在其上DNA也是5’—〉3’方向合成，但与复制叉移动的方向正好相反，故随着复制叉的移动形成许多不连续的冈崎片段，最后在连成一条完整的DNA链，该链称为后随链(laggingstrand)。两条单链DNA复制的引发过程有所差异，但是不论是前导链还是后随链，都需要一段RNA引物用于开始子链DNA的合成。因此前导链与后随链的差别在于前者从复制起始点开始按5’—3’持续的合成下去，不形成冈崎片段，后者则随着复制叉的出现，不断合成长约2—3kb的冈崎片段。
DNA新生链的合成由DNA聚合酶Ⅲ所催化，然而，DNA必须由螺旋酶在复制叉处边移动边解开双链。这样就产生了一种拓扑学上的问题:由于DNA的解链，在DNA双链区势必产生正超螺旋，在环状DNA中更为明显，当达到一定程度后就会造成复制叉难再继续前进，从而终止DNA复制。但是，在细胞内DNA复制不会因出现拓扑学问题而停止。有两种机制可以防止这种现象发生:[1]DNA在生物细胞中本身就是超螺旋，当DNA解链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋所中和;[2]DNA拓扑异构酶Ⅰ要以打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态，而DNA拓扑异构酶Ⅱ(旋转酶)可以在DNA解链前方不停地继续将负超螺旋引入双链DNA。这两种机制保证了无论是环状DNA还是开环DNA的复制顺利的解链，再由DNA聚合酶Ⅲ合成新的DNA链。前已述及DNA生长链的延伸主要由DNA聚合酶催化，该酶是由7种蛋白质(多肽)组成的聚合体，称为全酶。全酶中所有亚基对完成DNA复制都是必需的。α亚基具有聚合功能和5'→3'外切酶活性，ε亚基具有3'→5'外切酶活性。另外，全酶中还有ATP分子它是DNA聚合酶Ⅲ催化第一个脱氧核糖核苷酸连接在RNA引物上所必需的，其他亚基的功能尚不清楚。
在DNA复制叉处要能由两套DNA聚合酶Ⅲ在同一时间分别进行复制DNA前导链和滞后链。如果滞后链模板环绕DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通过DNA聚合酶Ⅲ，然后再折向与未解链的双链DNA在同一方向上，则滞后链的合成可以和前导链的合成在同一方向上进行。
这样，当DNA聚合酶Ⅲ沿着滞后链模板移动时，由特异的引物酶催化合成的RNA引物即可以由DNA聚合酶Ⅲ所延伸。当合成的DNA链到达前一次合成的冈崎片段的位置时，滞后链模板及刚合成的冈崎片断便从DNA聚合酶Ⅲ上释放出来。这时，由于复制叉继续向前运动，便产生了又一段单链的滞后链模板，它重新环绕DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通过DNA聚合酶Ⅲ开始合成新的滞后链冈崎片段。通过这样的机制，前导链的合成不会超过滞后链太多(最后只有一个冈崎片段的长度)。而且，这样引发体在DNA链上和DNA聚合酶Ⅲ以同一速度移动。
按上述DNA复制的机制，在复制叉附近，形成了以两套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引发体和螺旋构成的类似核糖体大小的复合体，称为DNA复制体(replisome)。复制体在DNA前导链模板和滞后链模板上移动时便合成了连续的DNA前导链和由许多冈崎片段组成的滞后链。在DNA合成延伸过程中主要是DNA聚合酶Ⅲ的作用。当冈崎片段形成后，DNA聚合酶Ⅰ通过其5'→3'外切酶活性切除冈崎片段上的RNA引物，同时，利用后一个冈崎片段作为引物由5'→3'合成DNA。最后两个冈崎片段由DNA连接酶将其接起来，形成完整的DNA滞后链。
实验证明DNA的复制是由一个固定的起始点开始的。一般把生物体的单个复制单位称为复制子。一个复制子只含一个复制起点。一般说，细菌，病毒即线粒体DNA分子均作为单个复制子完成其复制，真核生物基因组可以同时在多个复制起点上进行双向复制，即它们的基因组包括多个复制子。多方面的实验结果表明，大多数生物内DNA的复制都是从固定的起始点以双向等速方式进行的。复制叉以DNA分子上某一特定顺序为起始点，向两个方向等速生长前进。
(三)DNA复制的终止
过去认为，DNA一旦复制开始，就会将该DNA分子全部复制完毕，才终止其DNA复制。但最近的实验表明，在DNA上也存在着复制终止位点，DNA复制将在复制终止位点处终止，并不一定等全部DNA合成完毕。但目前对复制终止位点的结构和功能了解甚少在NDA复制终止阶段令人困惑的一个问题是，线性DNA分子两端是如何完成其复制的?已知DNA复制都要有RNA引物参与。当RNA引物被切除后，中间所遗留的间隙由DNA聚合Ⅰ所填充。但是，在线性分子的两端以5'→3'为模板的滞后链的合成，其末端的RNA引物被切除后是无法被DNA聚合酶所填充的。
在研究T7DNA复制时，这个问题部分地得到了解决。T7DNA两端的DNA序列区有160bp长的序列完全相同。而且，在T7DNA复制时，产生的子代DNA分子不是一个单位T7DNA长度，而是许多单位长度的T7DNA首尾连接在一起。T7DNA两个子代DNA分子都会有一个3'端单链尾巴，两个子代DNA的3'端尾巴以互补结合形成两个单位T7DNA的线性连接。然后由DNA聚合酶Ⅰ填充和DNA连接酶连接后，继续复制便形成四个单位长度的T7DNA分子。这样复制下去，便可形成多个单位长度的T7DNA分子。这样的T7DNA分子可以被特异的内切酶切开，用DNA聚合酶填充与亲代DNA完全一样的双链T7DNA分子。
在研究痘病毒复制时，发现了线性DNA分子完成末端复制的第二种方式。痘病毒DNA在两端都形成发夹环状结构。DNA复制时，在线性分子中间的一个复制起点开始，双向进行，将发夹环状结构变成双链环状DNA。然后，在发夹的中央将不同DNA链切开，使DNA分子变性，双链分开。这样，在每个分子两端形成一个单链尾端要以自我互补，形成完整的发夹结构，与亲代DNA分子一样。在真核生物染色体线性DNA分子复制时，尚不清楚末端的复制过程是怎样进行的。也可能像痘病毒那样形成发夹结构而进行复制。但最近的实验表明，真核生物染色体末端DNA复制是由一种特殊的酶将一个新的末端DNA序列加在刚刚完成复制的DNA末端。这种机制首先在四膜虫中发现。该生物细胞的线性DNA分子末端有30-70拷贝的5'TTGGGG3'序列，该细胞中存在一种酶可以将TTGGGG序列加在事先已存在的单键DNA末端的TTGGGG序列上。这样有较长的末端单链DNA，可以被引物酶重新引发或其他的酶蛋白引发而合成RNA引物，并由DNA聚合酶将其变成双链DNA。这样就可以避免其DNA随着复制的不断进行而逐渐变短。
在环状DNA的复制的末端终止阶段则不存在上述问题。环状DNA复制到最后，由DNA拓扑异构酶Ⅱ切开双链DNA，将两个DNA分子分开成为两个完整的与亲代DNA分子一样的子代DNA。
