从毛发中提取胱氨酸 同型半胱氨酸偏高

从毛发中提取胱氨酸

胱氨酸是由两个β-巯基-a-氨基丙酸组织的含硫氨基酸,学名为双巯丙氨酸,白色六角形板状晶体或结晶粉末,不溶于乙醇、乙醚,难溶于水。易溶于酸、碱溶液,但在热碱溶液中可被分解。胱氨酸存在于人发、猪毛、羊毛、马毛、羽毛及动物角等的蛋白质中,其中人发含量最高,达17.6%。胱氨酸是氨基酸中最难溶于水的一种,因此可利用这种特性,通过酸性水解,从废杂猪毛、人发、鸡毛、羊毛等角蛋白中,分离提取胱氨酸。

原理:利用L—胱氨酸的等电点不同(ph=5)及在水和乙醇中的溶解度远小于其他氨基酸等原因分离提纯L—胱氨酸。

(一)原料及试剂

1.毛发 原料要干净,零散的毛发比较容易水解。

2.盐酸 用作水解液, 25%~30%(6mol/lHCL)、13%~14%(1~1.5mol/lHCL)。

3.氢氧化钠用作调节PH值,可选用浓度30%~40%氢氧化钠溶液。

4.醋酸钠 作调节PH值用,选用化学纯试剂。

5.氨水(10%用于调节PH值,选用化学纯试剂。

6.活性炭(占结晶质量的5%~10%) 这里用作脱色剂,选用糖用和医用两种。

7.骨炭粉主要成分是磷酸三钙、骨胶和脂肪。不溶于水。这里作脱水剂,

8.二乙胺四乙酸(EDTA 0.1%) 用于脱铁,选用化学纯试剂。

9.硫酸铜 用于判定反应终点,选用化学纯试剂。

10、无水乙醇清洗氯离子

(二)设备

三口瓶、球星冷凝器、加热套、滴液漏斗、玻璃漏斗、加热漏斗、搪瓷盘、玻璃布、涤纶布、白纱布、温度计(0~150℃)、酸度计 (或精密PH试纸)、抽滤仪器(布氏漏斗)、试管(1*10厘米)、20支、滴管、烧杯(1000毫升)、移液管(1毫升、5毫升、10毫升)、量筒(1000毫升、500毫升、100毫升)、恒温水浴、容量瓶(100毫升、50毫升)、搅拌器

(玻璃钢水解罐、耐酸锅、搪瓷缸、搪瓷缸、搪瓷桶、离心机、3号重熔漏斗、2号砂芯漏斗)

(三)实验操作

1.工艺流程

废杂毛(人发)→(60~80℃左右的热水清洗)→80~90℃烘干,干净废杂毛→(102~110℃水解)→水解液→(40~60℃中和,至ph=4.8~5,搅拌30min)→胱氨酸粗品→(提纯)→沉淀物(粗品)→(精制)→结晶→(干燥)→精品

2.操作步骤

(1)清洗:除去废杂毛内混杂的泥沙、石块、草木、铁杂物等,用60~80℃左右的热水,加少量洗涤剂(纯碱),搅拌洗涤4~6分钟,洗取吸附在杂毛上的油脂,然后捞出,再用清水冲洗干净,滤干,放在通风处晒干或烘干备用。

(2)水解:a、在1000ml三口瓶中放入人发,按废杂人发量,取2倍30%盐酸,放入1000ml的三口瓶中,放入一端封口的毛细管(加热时一定要离开加热套)。装好料后的三口瓶放入加热套中装好冷凝器,温度计,每半个小时计一次温度由沸腾起6h后出料(整个水解过程必须与大气相通)。反应趁热过滤,滤液在三口瓶中。

b、(加入到玻璃钢或搪瓷水解罐中,通蒸气加热到70~80℃,立即投入已清洗晒干的废杂毛适量,继续加热,间隙搅拌,使温度均匀。)

升温到100℃时开始记温,每隔半小时记温1次,在1~1.5小时内升温至110℃左右(即灌温),以后继续维持灌压14.7千帕(气压490千帕),水解13小时左右(用玻璃钢盘管加热,水解时间可缩短为6~7小时),水解期间要有回流装置,保证水解酸度,使水解更完全。水解时间可从水解罐内溶液温度达100℃时计算起。

水解完全后,停止回流(回收的盐酸可重用),立即趁热过滤。这时过滤很困难,应先用玻璃布抽滤除去大的黑腐质,然后再用双层纱布抽滤,将滤液移到中和锅或缸中,滤液用1:1(体积比)的盐酸冲洗2~3次,冲洗液一并倒入中和锅或缸内,准备中和。

从毛发中提取胱氨酸 同型半胱氨酸偏高

(3)中和:三口瓶中滤液在40C以下装上搅拌器、滴液漏斗(内30%NaOH)、温度计在搅拌下加NaOH溶液(将过滤好的滤液趁热在搅拌下加入浓度30%~40%氢氧化钠溶液(工业烧碱),当ph=3时要缓慢滴加,直到PH值达4.0时,停止加碱液,然后改用醋酸钠饱和溶液中和到PH值为4.8左右,停止搅拌,静置10~12小时,用涤纶布过滤沉淀物,甩干或吊干(抽滤液可供回收谷氨酸或制备化学酱油),即得粗品。中和时温度应保持在40~60℃左右,而且要在半小时内完成。

(4)提纯:称取适量的胱氨酸粗品,加入粗品量用浓度为30%盐酸,搅拌30分钟左右,等粗品全部溶解后,再加入粗量质量4%~5%活性炭粉(分两次加)和二乙胺四乙酸(EDTA 0.1%),煮沸0.5h。然后过滤脱色液(回收活性炭粉,再生后可重用),滤液加热到80~85℃,在搅拌下加入浓度30%氢氧化钠溶液,调节PH值至4.8时,停止加碱液,静置,使结晶沉淀完全。虹吸上清液(可供回收胱氨酸和酪氨酸),底部沉淀滤干后可离心甩干或直接用吊包吊干,即得灰白色的提纯胱氨酸粗品。

(5)精制、干燥:称取适量胱氨酸提纯后的粗品,加入5倍量的1:12(体积比)13%~14%的盐酸(1~1.5mol/l),加热到40℃时,加入5%~10%的活性炭骨炭粉(按粗品量加),升温到60℃,保温搅拌1小时。然后用布氏漏斗多次过滤,滤液应无色透明,如仍带色,再进行脱色处理。

将冷的滤液移入搪瓷缸中,搅拌下加入10%氨水调节溶液PH值至4.8,静置一夜,即有胱氨酸精品析出,过滤出结晶,先用少量蒸馏水清洗再用无水乙醇清洗直至无氯离子,用吊布吊干后放入搪瓷盘中在烘箱内烘干(保持温度在60℃左右),即得产品。

(四)工艺条件说明

1.水解终点的判定毛发角蛋白是由胱氨酸、精氨酸等十几种氨基酸构成的。经酸水解后利用等电点沉淀法提取光氨酸,收率基本稳定在3%~4%,最高平均收率7%~8%。要提高从毛发中提取光氨酸的产量,主要取决于毛发的水解程度。如果酸浓度高,试剂速度液加快,反之则试剂速度慢。另一方面,水解时间也很关键,时间短,水解不彻底,时间长,则氨基酸被破坏,因此正确判断水解终点,控制水解时间很重要。

水解终点的判断:取水解进行10小时以上的水解液2毫升放在一支试管中,然后加入10%氢氧化钠溶液2毫升,再滴加2%硫酸铜溶液3~4滴,摇匀后,如仍有明显蓝色即表明水解已完全,如颜色变化则表明水解不完全,应继续水解。

2.酸度的控制 在操作过程中,调节PH值时最好用酸度计检查,特别是调节PH值至4.8左右时(胱氨酸等电点为5.05),一定要调节好,不然会产生结晶不易析出的现象。

3.温度的控制 温度对于水解很重要,温度低,反应时间长;温度高,虽可加快水解,但对胱氨酸有破坏作用。生产中,水解温度多控制在102~110℃左右,中和和脱色温度控制在70~80℃,以防止其它氨基酸析出。

4.如何提取产率 目前从废杂毛中提取胱氨酸,提取率多在4%~8%之间,一般人发的提取率较其它毛发高。最关键的步骤是水解、中和及过滤,应细心操作,掌握规律。另外水解时,水解罐应装有回流装置。

(五)产品规格和杂质测定

1、外观:产品为白色有光泽的六角形片状结晶粉末,在水中微溶,不溶于酸和有机溶剂,能溶于无机酸中。

2、澄明度:精确称取0.5克样品,加1:3盐酸溶液10毫升,振荡溶解,溶液应无色透明或几乎透明。

3、氯化物测定:精确称取0.25克样品,加1摩尔/升硝酸10毫升,使之溶解,再加水稀释至50毫升。用10毫升移液管吸取10毫升该溶液于一烧杯中,再加蒸馏水40毫升,1摩尔/升硝酸1毫升,1摩尔/升硝酸银溶液1毫升,摇匀。另外取氯化物标准液(1毫升含0.01毫克氯离子)7.5毫升,按上法同样处理,前者的浑浊度不应大于后者,即含氯量≤0.05%。

4、铁盐检验:取上述2克样品烧遗留的残渣于烧杯中,加2摩尔/升盐酸12毫升、1摩尔/升硝酸0.5毫升,在水浴中蒸干,再加1:2盐酸5毫升、蒸馏水10毫升,然后移入50毫升纳氏比色管中,加10%硫氰酸铵溶液2毫升,如显色,即与同样处理后的6毫升标准液比较,不得更深(≤0.001)。

试验提示:

a、中和放热,要控制滴加速度,特别是ph=3.8后要缓慢滴加,在控制ph时要注意温度。

b、脱色时要控制酸度及温度,活性炭不要太多,多次脱色直至无色透明。

c、水解时要完全回流,设有冷凝回流装置(冷凝管),实验过程中要处理掉会发出来的氯化氢气体。

d、不用ph试纸,用ph计(酸度计或精密ph试纸),否则L—胱氨酸不易结晶吸出。

e、用薄膜透析法回收盐酸,减少水解中酸的用量,同时用电透析法从脱去结晶后的氨基酸溶液中回收氨基酸。

  

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