爱华网一直以为cDNA是双链，老师问我生化是怎么学的？哎，底子薄终究是站不住脚的。现将这方面的知识温习一下。
真核生物的mRNA的3'末端具有一段大约150-200bp的多聚腺苷酸尾巴（原核生物没有3’端A尾巴，或者很短），该结构能够保护mRNA免受核酸外切酶的攻击，同时能够终结转录以及将mRNA从细胞核输出并进行翻译都起着十分重要的作用。
cDNA的概念简单来说是以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成与模板RNA互补的单链DNA。模板RNA可以是总RNA，mRNA，以及体外转录的RNA产物，但无论是哪种，要确保没有RNA酶和DNA的污染。对于原核生物，因为没有多聚A尾，因此只能用随机引物（主要是色氨酸tRNA，6-10个核苷酸）,在RNA逆转录酶（依赖RNA的DNA聚合酶）的催化作用下从5'→3'端合成与模板RNA互补的cDNA单链，形成RNA-DNA杂交双链。对于真核生物，除了可以用随机引物，还可以用oligoT（多聚胸腺嘧啶寡核苷酸链）作为引物与模板的3’端结合，从而形成杂交双链。
cDNA的第二条链是如何形成的呢？一种情况是利用 cDNA 第一链的 3'末端常常出现发夹环的特征，这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“返折”并且进行复制第一链的结果，它为合成 cDNA第二链提供了有用的引物。用这种方法合成的双链 cDNA 在一端有一个发夹环，可以用单链特异的 S1 核酸酶切去。但是 S1核酸酶的处理，常常会“修剪 ” 过多的 cDNA 顺序，使 cDNA 丢失了 mRNA 5' 端的部分顺序。 另一种方法是用大肠杆菌的RNase H 进行修饰。 RNase H 能识别 RNA-DNA杂交分子并把其中的 RNA 切割成短的片段，这些 RNA 短片段仍与cDNA 第一链结合，可被新合成的 DNA 所取代。新合成的 DNA 存在切口，用 DNA 连接酶把这些切口连接在一起形成一条完整的DNA 链。 RNase H 法优于 S1 核酸酶法，它能获得包括 mRNA 5' 端全部或绝大部分的更长顺序 cDNA分子。
在以cDNA为模板的时候，为什么要设计正反两条引物呢？第一回合pcr以cDNA单链为模板，退火时正向引物与模板结合，从而合成与模板互补的第二条cDNA链。第二轮pcr开始时，两条引物均发挥作用，产物成指数增长。正向引物可与oligoT配对形成双引物，但反向引物和oligoT就不可以，原因是反向引物和oligoT方向相同，可以看做是同一个引物。
