只有卡那霉素抗性基因怎么筛选导入重组质粒?——蓝白斑筛选法 质粒的抗性

只有卡那霉素抗性基因怎么筛选导入重组质粒?——蓝白斑筛选法 质粒的抗性


蓝白斑筛选法

2007年天津高考试题部分)在培育转基因植物的研究中,卡那霉素抗性基因(kan)常作为标记基因,只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。

请据图回答:

2C过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外,还必须加入

答案:卡那霉素

学生问题:未导入目的基因之前,质粒上已经有标记基因(如卡那霉素抗性基因),那无论是否导入目的基因,导入重组质粒与普通质粒用选择培养基(如加卡那霉素)筛选不是都有抗性吗?

高中生物中,以前学习过影印法筛选导入目的基因的问题,那是因为质粒上有两个抗性基因(如抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因)。假如只有一个抗性基因怎么筛选?

查找资料发现,筛选目的基因的导入还是有多种方法,这里再学习一种方法——显色反应筛选法(蓝白斑筛选法),当然质粒也是特定的种类才行。

常见的抗药性筛选法是用插入失活原理筛选重组DNA的方法。对菌落平板进行影印复制,通过两个平板的比较,才能辨别插入失活的表型特征。这样的筛选方法相对麻烦。

科学家利用某些质粒(如M13噬菌体载体,pUC质粒系列、pGEM质粒系列)都含有一个基因lacZ基因(β-半乳糖苷酶基因),它编码β-半乳糖苷酶的α肽,而宿主细胞为lacZ基因的突变株。当将上述载体的转化细胞培养在含有X-galIPTG平板中,由于基因内互补作用,产生有生物活性的β-半乳糖苷酶,把培养基中的无色X-gal分解成半乳糖和呈蓝色的5--4-靛蓝,使菌落呈蓝色。

若将外源目的基因插入到载体上lacZ基因序列中,使β-半乳糖苷酶的α肽基因失活,失去α-互补作用,将重组体转化细胞培养在含有X-gal和IPTG平板上,菌落呈无色。

也就是说,控制合成某种酶,是为我们插入目的基因筛选而用的。lacZ基因本身在IPTGx-gal的作用下,而产生蓝斑。而且这个基因上有很多的酶切位点,方便我们插入自己想要的基因。而我们的基因插入后,把lacZ基因破坏了,不能产生蓝斑。这种方法就叫蓝白斑筛选法。

附:

2010年浙江省五校)大肠杆菌pUC118质粒的某限制酶唯一酶切序列,位于该质粒的lacZ基因中,lacZ基因中如果没有插入外源基因,lacZ基因便可表达出β-半乳糖苷酶,当培养基中含有IPTGX-gal时,X-gal便会被β-半乳糖苷酶水解成蓝色,大肠杆菌将形成蓝色菌落;如果lacZ基因中插入了外源基因,带有pUC118质粒的大肠杆菌便不能表达β-半乳糖苷酶,培养基中的X-gal不会被水解成蓝色,大肠杆菌将形成白色菌落。pUC118还携带了氨苄青霉素抗性基因。下图是利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒示意图。据图回答下列问题:


1)作为受体大肠杆菌应__________________________,以方便筛选已导入重组质粒的受体大肠杆菌。取用氯化钙溶液处理(增加其细胞壁的通透性)过的受体大肠杆菌,置于试管Ⅱ中,并加入

2)图中的选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外,还应加入____________________等物质,用以筛选导入了重组质粒的受体大肠杆菌。

3)将上述处理后的大肠杆菌置于图中选择培养基上培养,以检测受体大肠杆菌是否导入重组质粒,请预测菌落的颜色,并分析结果:

  ①

  ②

答案:(1)不含氨苄青霉素抗性基因(或对氨苄青霉素敏感)在试管Ⅰ中制备好的DNA2IPTGX-gal、氨苄青霉素

3)①如果长出蓝色菌落,说明自连的运载体pUC118质粒已转入受体菌,但目的基因没有接入运载体(或说明重组质粒没导入受体大肠杆菌)  

②如果长出白色菌落,说明重组质粒已导入受体大肠杆菌

  

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