琼脂糖凝胶电泳的操作步骤 生物工程师考试

琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下:

1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液.

2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加

琼脂糖凝胶电泳的操作步骤 生物工程师考试
1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.

3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序).

4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.

(5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min.

(6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存

实验原理

闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同,在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率,因而在紫外灯下观察,能区别闭合环状质粒DNA(cccDNA)、线性质粒DNA(L-DNA)和开环质粒DNA(ocDNA)。

实验材料和试剂

(一)实验样品

质粒pUC118

(二)试剂

1.l DNA/HindIII分子量标准

2.溴酚蓝指示剂点样缓冲液

0.2% 溴酚蓝

50% 蔗糖

3.1mg/ml溴化乙锭溶液

4.电泳缓冲液(TAE)

40 mmol/L Tris-乙酸

1 mol/L EDTA

(配制方法:24.2克Tris碱,5.71ml冰乙酸,10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0),定容至5000ml)

5.0.7% 琼脂糖凝胶

(配制方法:称取琼脂糖0.35克,加入50ml TAE电泳缓冲液)

(三)仪器

微量移液器 电泳仪

水平电泳槽 透射紫外观察仪

实验步骤

1.选择合适的水平式电泳槽,调节电泳槽平面至水平。检查稳压电源与正负极的线路。

2.选择孔径大小合适的点样梳子,垂直架在电泳胶模的一端,使点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm。

3.制备0.7%琼脂糖凝胶,100℃水浴加热至琼脂糖融化均匀。

4.用吸管取少量琼脂糖凝胶溶液将电泳胶模四周密封好,防止浇灌琼脂糖凝胶板时发生渗透。待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时,加入一滴溴化乙锭,摇匀,轻轻倒入电泳胶模中,琼脂糖凝胶的厚度在3~5mm。倒胶时要避免产生气泡,若有气泡可用吸管小心吸去。

5.琼脂糖凝胶凝固后,在室温放置20分钟,小心拔掉点样梳子和电泳胶模两端的挡板,保持点样孔的完好。

6.将电泳胶模放入电泳槽中,加入电泳缓冲液,使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝胶表面1~2mm。如点样孔内有气泡,用吸管小心吸出,以免影响加样。

7.将15ml DNA样品与1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。上样缓冲液不仅可以提高样品的密度,使样品均匀沉到样品孔内,还可以使样品带颜色,便于上样和估计电泳时间和判断电泳的位置。

8.用微量移液器将样品小心加入加样孔内,记录样品点样秩序。

9.盖上电泳槽,开启电源开关,最高电压不超过5V/cm(100~150V恒压电泳),使DNA从负极向正极移动。

10.电泳时间随实验的具体要求而异。电泳一般需1~3小时。电泳完毕后关闭电源,戴一次性塑料手套取出凝胶,尽可能将所有的电泳缓冲液淋干,在254nm波长的透射紫外灯下观察。

【提示】

(一)琼脂糖凝胶电泳

1.琼脂糖凝胶的性质

琼脂糖是从海藻中提取的一种直链多糖,它由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成的线型多聚糖。当琼脂糖加热至90~100℃左右,即可形成清亮透明的液体。浇在模板上冷却至40~45℃时,凝固形成凝胶。琼脂糖带有亲水性,不含有带电荷的基团,不引起DNA变性,又不吸附被分离的物质,因此它是一种很好的凝胶剂。琼脂糖凝胶可区分相差100bp的DNA片段。

2.DNA分子的迁移率

DNA分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的,除了决定于DNA分子大小与构型外,还有琼脂糖凝胶的浓度、电压大小、缓冲液pH值和电泳时的温度等。

(二)实验操作中注意的问题

1.加热溶解琼脂糖时应不断地摇动容器,使附于壁上的颗粒也完全溶解。

2.溴化乙锭是一种强致癌剂,并有中度毒性,因此必须十分谨慎小心。操作时一定要戴手套,用过的手套要及时将手套顺手翻过来,让污染有溴化乙锭的面朝里。

3.用254nm波长的紫外光进行观察的效果比366nm清晰,但产生的切口DNA量也较高。紫外光对眼睛有害,观察时应戴上眼镜或防护面罩。

  

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