化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则 抗菌药物指导原则

【H 】G P H 5 - 1 指导原则编号:

化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则

(第二稿)

二OO 四年三月十九日

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目录

一、概述………………………………………………………4

二、方法验证的一般原则……………………………………5

三、方法验证涉及到的三个要素……………………… 5

1、需要验证的检测项目…………………………………… 5

2、分析方法………………………………………………… 6

3、验证内容………………………………………………… 7

四、方法验证的具体内容……………………………………7

(一) 专属性……………………………………………… 7

1、鉴别反应………………………………………………… 7

2、杂质检查………………………………………………… 7

3、含量测定………………………………………………… 8

(二) 线性……………………………………………………8

(三) 范围……………………………………………………9

1、含量测定………………………………………………… 9

2、制剂含量均匀度………………………………………… 9

3、溶出度或释放度………………………………………… 9

4、杂质…………………………………………………… 10

(四) 准确度……………………………………………… 10

1、含量测定………………………………………………… 10

2、杂质定量试验…………………………………………… 10

2

(五) 精密度…………………………………………………11

1、重复性…………………………………………………… 11

2、中间精密度……………………………………………… 12

3、重现性…………………………………………………… 12

(六) 检测限…………………………………………………12

1、直观法……………………………………………………12

2、信噪比法………………………………………………… 12

(七) 定量限…………………………………………………13

1、直观法……………………………………………………13

2、信噪比法………………………………………………… 13

(八) 耐用性…………………………………………………14

(九)系统适用性试验………………………………………14

五、方法再验证………………………………………………15

六、方法验证的评价………………………………………16

1、有关方法验证评价的一般考虑………………………… 16

2、方法验证的整体性和系统性…………………………… 16

七、参考文献……………………………………………… 17

八、起草说明……………………………………………… 18

九、著者…………………………………………………… 20

3

质量控制分析方法验证的技术指导原则

一、概述

保证药品安全、有效、质量可控是药品研发和评价应遵循的基

本原则,其中,对药品进行质量控制是保证药品安全有效的基础和前

提。为达到控制质量的目的,需要多角度、多层面来控制产品质量,

也就是说要对药物进行多个项目测试,来全面考察产品质量。一般地,

每一测试项目可选用不同的分析方法,为使测试结果准确、可靠,必

须对所采用的分析方法的科学性、准确性和可行性进行验证,以充分

表明分析方法符合测试项目的目的和要求,这就是通常所说的对方法

进行验证。

方法验证的目的是判断采用的分析方法是否科学、合理,是否能

有效控制产品的内在质量。从本质上讲,方法验证就是根据检测项目

的要求,预先设置一定的验证内容,并通过设计合理的试验来验证所

采用的分析方法是否满足检测项目的要求。

方法验证在分析方法建立过程中具有重要的作用,并成为质量研

究和质量控制的组成部分。只有经过验证的分析方法才能用于控制产

品质量,因此方法验证是制订质量标准的基础。方法验证是药物研究

过程中的重要内容。

本指导原则重点探讨方法验证的本质,将分析方法验证的要求

与所要达到的目的结合起来进行系统和规律性的阐述,重点阐述如何

科学合理地进行论证方案的设计。

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本指导原则主要包括方法验证的一般原则、方法验证涉及的三

个要素、方法验证的具体内容、对方法验证的评价等内容。

本原则与其他相关技术指导原则一起构成较完整的质量控制指

导原则。

随着我国新药研发水平的不断提高,对方法验证的认识也会不

断深入,本指导原则将会逐步完善和修订。

由于生物制品和中药特殊性,本原则主要适用于化学药品。

二、方法验证的一般原则

原则上每个检测项目采用的分析方法,均需要进行方法验证。

方法验证的内容应根据检测项目的要求,结合所采用分析方法的

特点确定。

同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。例如,

采用高效液相色谱法用于制剂的鉴别和杂质定量试验应进行不同的

方法验证时,前者重点要求验证专属性,而后者重点要求验证准确性、

专属性、定量限。

三、方法验证涉及的三个要素

方法验证涉及到需要验证的检测项目、分析方法和验证内容三个

要素,简述如下。

1、需要验证的检测项目

检测项目是为控制产品质量,保证安全有效而设定的测试项目。

根据检测项目的设定目的和验证内容的不同要求,本指导原则将需验

证的检测项目分为鉴别、杂质检查(限度试验、定量试验)、定量测

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定(含量测定、溶出度、释放度等)、其他特定检测项目等四类。

鉴别的目的在于判定被分析物是目标化合物,而非其它物质,用

于鉴别的分析方法要求具有较强的专属性。

杂质检查主要用于控制主成分以外的杂质,如有机杂质、无机杂

质等。杂质检查可分为限度试验和定量试验两种情况。限度试验通常

指氯化物、硫酸盐、重金属、砷盐、炽灼残渣、干燥失重、水分等检

查。定量试验一般包括有关物质、有机溶剂残留量等检查。用于限度

试验的分析方法验证侧重检测限和专属性。用于定量试验的分析方法

验证强调定量的准确性、灵敏度和专属性。

定量测定包括含量测定、制剂的溶出度测定等,由于此类项目对

准确性要求较高,故所采用的分析方法要求具有一定的准确性、专属

性和范围。

其他特定检测项目包括粒径分布、旋光度、分子量分布等,由于

这些检测项目的要求与鉴别、杂质检查、定量测定等有所不同,对于

这些项目的分析方法验证应有不同的要求。

2、分析方法

本指导原则所指分析方法是为完成上述各检测项目而设定和建

立的测试方法,一般包括分析方法原理、仪器及仪器参数、试剂、系

统适用性试验、供试品制备、对照品溶液制备、测定、计算及测试结

果的报告等。

测试方法可采用化学分析方法和仪器分析方法。这些方法各有特

点,同一测试方法可用于不同的检测项目,但验证内容可不相同。

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3、验证内容

验证内容包括验证方法的专属性、线性、范围、准确度、精密度、

检测限、定量限、耐用性和系统适用性等。

四、方法验证的具体内容

对具体的验证内容分别说明如下。

(一)专属性

专属性系指在其他成分(如杂质、降解物、辅料等)可能存在

下,采用的分析方法能够准确测定被分析物质的特性的能力。

通常,鉴别、杂质检查、含量测定方法中均应考察其专属性。

如采用的方法不够专属,应采用多个方法予以补充。

1、鉴别反应

鉴别试验应确证被分析物符合其特征。专属性试验要求证明能

与可能共存的物质或结构相似化合物区分,需确证含被分析物的样品

呈正反应(可与已知对照物比较),而不含被测成分的样品呈负反应,

以及结构相似或组分中的有关化合物,也应呈负反应。

2、杂质检查

作为纯度检查,所采用的分析方法应确保可检出被分析物中杂质

的含量,如有关物质、重金属、残留溶剂等。因此杂质检查要求分析

方法有一定的专属性。

在杂质可获得的情况下,可向供试品中加入一定量的杂质,证

明杂质与共存物质能得到分离和检出,并具适当的准确度与精密度。

在杂质或降解产物不能获得的情况下,专属性可通过与另一种

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已证明是合适的、分离或检测原理不同、或具较强分辨能力的方法进

行结果比较来确定。或将供试品用强光照射,高温,高湿,酸、碱水

解及氧化的方法进行破坏(制剂应考虑辅料的影响),比较破坏前后

检出的杂质个数和量。必要时可采用二极管阵列检测和质谱检测,进

行色谱峰纯度检查。

3、含量测定

含量测定目的是得到样品中被分析物的含量或效价的准确结果。

在杂质可获得的情况下,对于主成分含量测定可在供试品中加入

杂质或辅料,考察测定结果是否受干扰,并与未加杂质和辅料的试样

比较测定结果。

在杂质或降解产物不能获得的情况下,可采用另一个经验证了

的或药典方法进行比较,比对两种方法测定的结果。也可采用破坏性

试验(强光照射,高温,高湿,酸、碱水解及氧化),得到含有杂质

或降解产物的试样,用两种方法进行含量测定比较测定结果。必要时

进行色谱峰纯度检查,证明含量测定成分的色谱峰中不包含其他成

分。

(二)线性

线性系指在设计的范围内,检测结果与试样中被分析物的浓度

(量)直接呈线性比例关系的能力。

线性是定量测定的基础,涉及定量测定的项目,如杂质定量试

验和含量测定均需要验证线性。

应在设计的范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释,

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或分别精密称样,制备一系列被测物质浓度系列进行测定,至少制备

5 个浓度。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图,观察是否

呈线性,用最小二乘法进行线性回归。

必要时,响应信号可经数学转换,再进行线性回归计算,并说

明依据。

(三)范围

范围系指能够达到一定的准确度、精密度和线性,测试方法适

用的试样中被分析物的高低限浓度或量的区间。

范围通常用与分析方法的测试结果相同的单位(如百分浓度)

表达。涉及到定量测定的检测项目均需要对范围进行验证,如含量测

定、含量均匀度、溶出度或释放度、杂质定量试验等。

范围应根据剂型和(或)检测项目的要求确定。

1、含量测定

范围应为测试浓度的80%~100%或更宽。

2、制剂含量均匀度

范围应为测试浓度的70%~130%。根据剂型特点,如气雾剂、

喷雾剂,必要时,范围可适当放宽。

3、溶出度或释放度

对于溶出度,范围应为限度的±20%;如规定限度范围,则应

为下限的-20%至上限的+20%。

对于释放度,如规定限度范围,从1 小时后为20%至24 小时后

为90%,则验证范围应为0~110%。

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4、杂质

杂质测定时,范围应根据初步实测,拟订出规定限度的±20%。

如果含量测定与杂质检查同时测定,用面积归一化法,则线性范围应

为杂质规定限度的-20%至含量限度(或上限)的+20%。

(四)准确度

准确度系指用该方法测定的结果与真实值或认可的参考值之间

接近的程度。有时也称真实度。一般以回收率(%)表示。

一定的准确度为定量测定的必要条件,因此涉及到定量测定的

检测项目均需要验证准确度,如含量测定、杂质定量试验等。

准确度应在规定的范围内建立。该指标的验证一般以回收率试

验来进行,试验设计需考虑在规定范围内,制备3 个不同浓度的样品,

各测定3 次,即测定9 次,报告已知加入量的回收率(%)或测定结

果平均值与真实值之差及其可信限。

1、含量测定

原料药可用已知纯度的对照品或样品进行测定,或用本法所得

结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。

制剂可用含已知量被测物的各组分混合物进行测定。如不能得

到制剂的全部组分,可向制剂中加入已知量的被测物进行测定,必要

时,与另一个已建立准确度的方法比较结果。

2、杂质定量试验

杂质的定量试验可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测

定。如果不能得到杂质或降解产物,可用本法测定结果与另一成熟的

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方法进行比较,如药典标准方法或经过验证的方法。

如不能测得杂质或降解产物的相对响应因子,可在线测定杂质

或降解产物的相关数据,如采用二极管阵列检测器测定紫外光谱,当

杂质的光谱与主成分的光谱相似,则可采用原料药的响应因子近似计

算杂质含量(自身对照法)。并应明确单个杂质和杂质总量相当于主

成分的重量比(%)或是面积比(%)。

(五)精密度

精密度系指在规定的测试条件下,同一均质样品,经多次取样

进行一系列检测所得结果之间的接近程度(离散程度)。精密度一般

用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。

该指标目的是考察分析方法在不同的时间、操作人员、试验室

下,所得结果的重现性和重复性。涉及定量测定的项目,如含量测定

和杂质定量试验应考察方法的精密度。

精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。用标准偏

差或相对标准偏差表示时,取样测定次数应有统计学意义,至少用6

次结果进行评价。

精密度可以从三个层次考察:重复性、中间精密度、重现性。

1、重复性

重复性系指在同样的操作条件下,在较短时间间隔内,由一个

分析人员测定所得结果的精密度。

重复性测定可在规定范围内,至少用9 次测定结果进行评价,

如制备3 个不同浓度的样品,各测定3 次,或采用同一批样品(把被

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测物浓度当作100%),用至少测定6 次的结果进行评价。

2、中间精密度

中间精密度系指在同一试验室,由于试验室内部条件改变,如

时间、分析人员、仪器设备、测定结果的精密度。

验证设计方案中的变动因素一般为日期、分析人员、设备。

3、重现性

指不同实验室之间不同分析人员测定结果的精密度。

当分析方法将被法定标准采用时,应进行重现性试验。

(六)检测限

检测限系指试样中的被分析物能够被检测到的最低量,但不一

定要准确定量。

该验证指标的意义在于考察方法是否具备灵敏的检测能力。因

此对杂质限度试验,需证明方法具有足够低的检测限,以保证需要控

制的杂质被测出。

1、直观法

直观评价可以用于非仪器分析方法,也可用于仪器分析方法。

检测限的测定是通过对一系列已知浓度被分析物的样品进行分

析,并以能准确(或被可靠)地检测被测物的最小量或最低浓度来建

立。

2、信噪比法

用于能显示基线噪音的分析方法,即把已知低浓度试样测出的

信号与空白样品测出的信号进行比较,算出能被可靠地检测出的最低

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浓度或量。一般以信噪比为3:1 或2:1 时相应的浓度或注入仪器的

量确定检测限。

其他方法有基于工作曲线的斜率和响应的标准偏差进行计算的

方法等。

无论用何种方法,均应用一定数量的样品,其浓度为近于或等

于检测限,进行分析,以可靠地测定检测限。

(七)定量限

定量限系指试样中的被分析物能够被定量测定的最低量,其测

定结果应具有一定的准确度和精密度。

该指标体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。杂质定

量检查,需考察方法的定量限,以保证含量很少的杂质能够被准确测

出。

常用信噪比法确定定量限。一般以信噪比为10:1 时相应的浓

度或注入仪器的量进行确定。

1、直观法

直观评价可以用于非仪器分析方法,也可用于仪器分析方法。

定量限一般通过对一系列含有已知浓度被测物的样品进行分

析,在准确度和精密度都符合要求的情况下,来确定被测物能被定量

的最小量。

2、信噪比法

用于能显示基线噪音的分析方法,即把已知低浓度试样测出的

信号与空白样品测出的信号进行比较,算出能被可靠地检测出的最低

13

浓度或量。一般可接受的信噪比是10:1。

其他方法有基于工作曲线的斜率和响应的标准偏差进行计算的

方法等。

无论用何种方法,均应用一定数量的样品,其浓度为近于或等

于定量限,进行分析,以可靠地测定定量限。

(八)耐用性

耐用性系指测定条件发生细小变动时,测定结果保持不受影响

的承受程度。

耐用性主要考察方法本身对于可变试验因素的抗干扰能力。开

始研究分析方法时,就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻,则

建议在方法中予以写明。

典型的变动因素包括:液相色谱法中流动相的组成和pH 值,不

同厂牌或不同批号的同类型色谱柱,柱温、流速等。气相色谱法中载

气及流速、不同厂牌或批号的色谱柱、固定相,担体、柱温,进样口

和检测器温度等。

经试验,应说明小的变动能否通过设计的系统适用性试验,以

确保方法有效。

(九)系统适用性试验

对一些仪器测试方法,在进行方法验证时,有必要将分析设备、

电子仪器与实验操作、被测试样品等一起当作完整的系统进行评估。

系统适用性便是对整个系统进行评估的指标。系统适用性试验参数的

设置需根据被验证方法类型而定。

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色谱方法对分析设备、电子仪器的依赖程度较高,因此所有色

谱方法均应进行该指标验证,并将系统适用性作为分析方法的组成部

分。具体验证参数和方法参考中国药典有关规定。

五、方法再验证

在某些情况下,如原料药合成工艺改变、制剂处方改变、分析

方法发生改变等,均有必要对分析方法再次进行全面或部分指标的验

证,以保证分析方法可靠,这一过程称为方法再验证。

再验证原则:根据改变的程度进行相应的再验证。

当原料药合成工艺发生改变时,可能引入新的杂质,杂质检查

方法和含量测定方法的专属性就需要再进行验证,以证明有关物质检

查方法能够检测新引入的杂质,含量测定方法中新引入的杂质对主成

份的测定无干扰。

当制剂的处方组成改变、辅料变更时,可能会影响鉴别的专属

性、溶出度和含量测定的准确度,因此需要进行辅料对鉴别、对含量

测定影响的方法再验证;当原料药产地来源发生变更时,可能会影响

杂质检查的专属性和含量测定的准确度,因此需要对杂质检查方法和

含量测定进行再验证。

当质量标准中某一项目分析方法发生改变时,如采用高效液相

色谱法测定含量时,检测波长发生改变,则需要重新提供检测限、专

属性、准确度、精密度、线性等相应的方法学研究资料,证明修订后

分析方法的合理性、可行性。

同样,已有国家标准的药品质量研究中,基于申报的原料药合

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成工艺、或制剂处方中的辅料等一般无法保证与已上市产品的一致

性,需对质量标准中部分项目进行方法的再验证。

方法再验证是对分析方法的完善过程,应根据实际改变情况进

行再验证,从而保证所采用的分析方法能够控制产品的内在质量。

六、对方法验证的评价

对于方法验证,有以下几个方面值得关注。

1、有关方法验证评价的一般考虑

总体上,方法验证应围绕验证目的和一般原则来进行,方法验

证内容的选择和试验设计方案应合理、充分,验证过程应规范严谨。

并非每个分析方法都要进行所有内容的验证。但同时也要考虑

验证指标应充分,足以证明采用的分析方法的合理性。如杂质的限度

试验分析方法一般需要验证专属性和检测限,而对于精密度、线性、

定量限等涉及定量测定的项目,则一般不需要进行验证。

2、方法验证的整体性和系统性

方法验证内容之间相互关联,是一个整体。因此不论从研发角

度还是评价角度,方法验证均注重整体性和系统性。

例如,对于鉴别项目所需要的专属性,一般一种分析方法不太

可能完全鉴别被分析物,此时采用两种或两种以上分析方法可加强鉴

别项目的整体专属性。

在方法验证指标之间也存在较多的关联性,可以相互补充。如

原料药含量测定采用容量滴定法时,由于方法本身原因,专属性略差,

但假如在杂质检测时采用了专属性较强的色谱法,则一般认为整个检

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化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则 抗菌药物指导原则

测方法也具有较强的专属性。

总之,由于实际情况较复杂,在方法验证过程中,具体情况应

具体分析,不提倡教条地去进行方法验证。此外,越来越多的新方法

不断被用于质量控制中,如小角度激光散射法控制粒径,对于这些方

法如何进行验证更需要具体情况具体分析,而不能照搬本指导原则。

七、参考文献

1. FDA.Guidance for Industry:analytical procedures and methods

validation,chemistry,manufacturing,and controls documentation(Draft),

2000.8。

2. ICH Q2A.Test on Validation of Analytical Procedures

3. ICH Q2B.Validation of Analytical Procedures:Methodology

4.中国药典2000 年版二部附录.药品质量标准分析方法验证

八、起草说明

(一) 背景资料

关于方法验证,美国、欧盟等药政管理当局出台了相关指导性

文件,对方法验证的具体内容进行了阐述和规定[1-3],中国药典2000

年版二部附录亦收载了药品质量标准分析方法验证内容[4]。为药品研

发和注册申请提供技术指导。

但目前我国药物研究中,在质量研究部分,方法学验证方面还

存在较多的问题,主要表现在:方法验证设计不科学、验证不充分、

试验过程不规范、验证数据不合理、忽视方法再验证等。

产生上述问题的原因之一是,已有的国内外指导原则主要告知

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研发者如何做,却较少阐述深层次的原因,研发者在药物研究时往往

不知技术要求背后深层次的原因。

针对这种情况,本指导原则重点探讨方法验证的本质,将分析

方法验证的要求与所要达到的目的结合起来进行系统和规律性的阐

述,重点阐述如何科学合理地进行论证方案的设计,希望能对研发提

供技术参考。

(二)本指导原则内容设置的考虑

本指导原则包括方法验证的一般原则、方法验证涉及的三个要

素、方法验证的具体内容、对方法验证的评价等内容。内容编排上,

先阐述方法验证的一般规律和基本要素,然后对方法验证的具体内容

进行阐述,以对一般规律有更深刻的理解。对方法验证的评价体现了

药物研究的整体性和系统性,符合药物研究规律,希望从评价角度给

研发者以有益的启示。

(三)方法验证的一般原则

该部分内容重点阐述对方法验证的一般认识和原则要求。强调验

证内容应根据检测项目的要求,同时考虑所采用分析方法的特点来进

行。

根据验证内容的不同要求,本文将检测项目分成鉴别、杂质检

查、定量测定、其他特定检测项目等四类,简要叙述了各自特点及对

方法验证的要求,其中,杂质检查分为限度试验和定量试验两种情况,

为澄清有关误解,正文部分又进行了进一步解释和说明,限度试验主

要指一般杂质检查,而定量试验主要包括有关物质检查和有机溶剂残

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留量检查等。本文所采取的分类方式是参考了FDA有关指导原则[1]的

分类,经重庆会议讨论后确定。

(四)方法验证的具体内容

此部分内容以验证内容为主线,明确各验证内容的含义,根据检

测项目的不同类型和要求,具体阐述方法验证的试验设计思路。此部

分主要内容参考了国内外有关文献[1-4],并结合了实际情况加以制订。

(五)关于方法再验证

在实际审评工作中,该方面遇到了较多的问题,因此单列一节,

希望引起研发企业的重视。原料药的合成路线改变、制剂处方改变;

已有国家标准产品如何进行方法验证的问题;检测方法发生改变时;

本节以上述情况举例说明如何进行方法再验证

(六)对方法验证的评价

此部分内容主要阐述了评价方法验证的基本观点,注重方法验

证的整体性和综合性。也希望通过该部分撰写启发研发企业系统地进

行方法验证。

(七)与其他指导原则的关联性问题

本指导原则与质量标准建立、有机溶剂研究、杂质研究等相关

指导原则具有相关性,不宜孤立地看待本指导原则。

九、著者

化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则课题研究组

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