zz 吡啶甲酸铬安全性研究进展 吡啶甲酸铬是西药吗

作者简介:毕晋明,北京华谷生物营养科技发展有限公司,硕士。张敏红,中国农业科学院研究员,博士生导师,主要从事动物营养方面研究

矿物元素是动物营养中的一大类无机营养素。目前已查明的必需微量元素有铁、锌、铜、锰、碘、硒、钴、钼、氟、铬、硼等12种,且必须由外界供给。各元素在供给量上存在一安全范围,添加量不足导致相应元素缺乏症,添加量超过安全范围便导致机体中毒。同时发现,畜禽对微量元素的耐受性也随动物种类而异。猪、禽对铁的耐受量为3000mg/kg、1000mg/kg,对铜的耐受量为250mg/kg、300mg/kg,其他微量元素同样具有类似效应。当微量元素在饲粮中含量较低时为必需矿物元素,在含量过高情况下则可能是有毒有害元素,必需矿物元素和有毒有害元素对动物而言是相对的。

铬元素作为必需微量元素之一,其生理作用日益受到研究者重视。研究表明:铬与糖代谢、脂代谢、蛋白质代谢以及核酸代谢密切相关。同时发现,各种动物对铬的耐受力都较强。可耐受铬的氧化物3000 mg/kg,铬的氯化物可耐受1000 mg/kg。吡啶甲酸铬作为有机铬制剂,其安全性也日益受到关注。在畜牧生产上,吡啶甲酸铬对缓解环境应激、提高瘦肉率、增强抵抗力均有明显的促进作用,而被广泛应用。但究其使用量而言,虽然一些国家已批准吡啶甲酸铬在畜禽日粮中的添加,但目前尚未正式发布动物最低需要量和最高耐受量数据。研究报道,血浆铬的正常生理浓度为0.1-2.1μg/ml(Cerulli et al., 1998),人类肝中铬的生理浓度为5.4-470ηg/g 肝湿重(-0.1-9μM)(Versieck,1985),超量添加(远高于生理剂量)吡啶甲酸铬有可能产生DNA毒性和细胞毒性。为此,本文对吡啶甲酸铬的安全性进行综述,以便为日后吡啶甲酸铬的研究提供理论基础。

1 吡啶甲酸铬理化特性及结构特征

吡啶甲酸铬(Chromium picolinate),分子式Cr(C6H4NO2)3,分子量为418.33,紫红色结晶性细小粉末,常温下稳定,微溶于水,不溶于乙醇。整个分子结构呈电中性,且具有疏水特性,因此可以以完整的结构进行跨膜吸收。吡啶甲酸铬的分子结构与GTF部分相似。1977年,Toepfer认为GTF是铬的生物活性形式,其结构为烟酸-铬-烟酸与天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸形成的配合体。吡啶甲酸铬的类GTF结构决定了自身较好的吸收率,并能更有效地发挥自身的生物学功能。据报道,普通铬制剂吸收率为0.5%左右,而吡啶甲酸铬吸收率达2%-5%(Anderson,1996)。

2 吡啶甲酸铬安全性研究

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吡啶甲酸铬作为营养添加剂,已经得到广泛的应用。但是从1995年首次报道了吡啶甲酸铬的危害性之后,吡啶甲酸铬的安全性问题就一直成为研究的热点。迄今为止,对吡啶甲酸铬的安全性研究已得到一些数据,但结论不尽相同。

据NTP(National Toxicology Program)报道,不管有无添加小鼠肝脏S9代谢激活物,吡啶甲酸铬对TA1535、TA97、TA98、TA100、TA102、TA104细胞株均未致突变性。在小鼠日粮中添加2500mg/kg.bw的一水吡啶甲酸铬,小鼠骨髓细胞未发现基因断裂效应。Kato等(1998)对十位肥胖女士(每日服用400mg吡啶甲酸铬)观察,八周后尿样中DNA碱基氧化产物5-羟甲基尿嘧啶水平没有发生变化。Anderson等(1997)向小鼠日粮中添加100mg/kg日粮的铬(吡啶甲酸铬形式),饲喂24周也未发现吡啶甲酸铬急性毒性。

针对超量添加吡啶甲酸铬时的细胞毒性和基因毒性也有研究报道。吡啶甲酸铬细胞毒性主要体现在细胞凋亡和线粒体损伤上。Manygoats(2002)研究发现,1mM(125倍适宜量)吡啶甲酸铬添加可导致线粒体损伤和细胞凋亡,可能是由于线粒体呼吸作用受到抑制(主要发生在复合体Ⅰ上),NADH的合成减少,消耗增大所致;线粒体内膜通道的破坏(线粒体的渗透性转换孔—MPT途径),导致线粒体基质成分丧失,线粒体功能和细胞器发生实质性膨胀,接着线粒体外膜破裂,细胞色素C和凋亡诱导因子释放,进而激活核酸内切酶和Caspase,引发细胞凋亡(Green D等,1998)。

吡啶甲酸铬基因毒性主要表现在DNA碱基氧化、DNA链断裂和基因突变上。Hepburn (2003)研究发现:给小鼠注射吡啶甲酸铬80天后(~600uM Cr, 75倍适宜量),造成脂质过氧化,并使尿中DNA碱基氧化产物8-oxo-dG含量升高。另有报道提示:在诸如维生素C之类的生物抗氧化剂存在的条件下,吡啶甲酸铬可以断裂DNA双链,使超螺旋DNA松弛。Stohs(1998)等研究发现,50mg/ml(120mM)吡啶甲酸铬处理巨噬细胞J774A.1 24h后,造成DNA链断裂,细胞中存在DNA碎片。Speetjens JK(1999)的体外实验研究发现:吡啶甲酸铬可以导致质粒DNA单链断裂。在小鼠淋巴细胞上的毒理试验表明:不管是否添加S9,1.2mM(150倍适宜量)、2.39mM吡啶甲酸铬均显著诱导淋巴细胞基因突变(Whittaker等,2005)。

由此可见,在体内研究吡啶甲酸铬的安全性上,除静脉注射途径外,未见毒性报道。这可能与吡啶甲酸铬的吸收率(2%-5%)以及机体内环境代谢有关;吡啶甲酸铬静脉注射途径的吸收率远高于肠道吸收率。体外细胞培养研究上,多数实验报道,超量添加吡啶甲酸铬(>0.6mM,75倍适宜量)对细胞和DNA产生毒性作用。但也有个别试验报道,高剂量吡啶甲酸铬(>0.6mM)对细胞和DNA不产生毒性作用,这可能与不同细胞株的耐受性不同和吡啶甲酸铬的吸收率降低有关。

3 超量添加吡啶甲酸铬毒性作用的代谢途径

迄今为止,从国内外吡啶甲酸铬安全性研究报道中发现,吡啶甲酸铬毒性作用与其代谢途径密切相关,其代谢途径主要归纳为两条。

3.1 吡啶甲酸铬氧化-还原途径

吡啶甲酸铬在胞内还原剂(维生素C,硫醇等)存在的条件下发生类Fenton反应。在此过程中生成大量对DNA稳定性影响的ROS,如超氧离子,过氧离子,羟基自由基,过氧化氢等。ROS的产生,使蛋白质、脂质过氧化生成羰基蛋白、脂质过氧化物等氧化产物,同时使细胞膜通透性、膜流动性降低,细胞脆性升高,细胞完整性遭到破坏。另一方面,ROS产生后降低了Ca2+-ATP酶与钙通道活性,造成Ca超载,从而激活Ca2+-依赖蛋白酶,磷脂酶(PLA2)及核酸内切酶(刘欣等,2001)。PLA2的激活,使膜磷脂降解,磷脂含量降低,导致膜通透性增加,Ca2+易于进入细胞内,使细胞内Ca2+超载,形成恶性循环。核酸内切酶的激活,催化基因组DNA 在核小体间降解; Ca2 +浓度的升高还可激活谷氨酰胺转化酶和蛋白激酶C 等,使细胞骨架断裂,细胞浆蛋白交叉联合,促使凋亡发生(Ui-Tei等,2000)。此外,Ca2+浓度的改变还可激活凋亡相关蛋白激酶与Caspase家族的级联反应,最终导致细胞凋亡。Fenton反应增强后,ROS基团可氧化DNA碱基。通过脱氧核糖的C8位点上的脱氢作用氧化DNA,使鸟嘌呤氧化成为8-oxo-dG;胸腺嘧啶氧化生成5-羟甲基尿嘧啶。

3.2 吡啶甲酸铬酶促分解途径

在胰岛素依赖性细胞中,Apo-LMWCr从吡啶甲酸铬复合体中对铬进行吸附,使吡啶甲酸脱离复合物,游离于胞内,从而造成细胞毒性。在体内吡啶甲酸是色氨酸的代谢产物,它的产生可以诱导一氧化氮合酶表达,导致氮自由基产生,进而引发细胞凋亡。吡啶甲酸还可改变细胞膜的流动性,并能阻止细胞周期(S期)循环。毒理学试验表明:吡啶甲酸在胞内可以螯合其他金属离子发生Fenton反应生成活性氧自由基,并且发现在磷酸盐缓冲液中,吡啶甲酸能增强Cr(pic)3的类Fenton反应。Stearns(2002)研究发现:1mM(120倍适宜量)的吡啶甲酸铬处理组48h后发现细胞存活率为(68±16)%,而吡啶甲酸组仅为27%;但是发现该浓度的吡啶甲酸并不存在致突变性。Manygoats (2002)等对CHO细胞研究发现:吡啶甲酸铬添加量为1mM时,48h后发现37%的细胞发生凋亡,当量的吡啶甲酸产生的细胞毒性比吡啶甲酸铬更强,1.5mM(180倍适宜量)的吡啶甲酸处理组的细胞成活率仅有49%,51%的细胞发生凋亡,71%的线粒体受损。另有研究发现:3mM浓度的吡啶甲酸24h后发现线粒体损伤,5-10mM的吡啶甲酸12-24h后细胞发生凋亡(Ogata等,1998)。可见在细胞毒性上,吡啶甲酸强于吡啶甲酸铬。

在微粒体中吡啶甲酸铬可分解并发生醯胺化、甲基化反应。将人微粒体与吡啶甲酸铬共同孵育1h和3h后,分析得出66%的吡啶甲酸铬被代谢,通过高压液相色谱分析两时间点的结果没有差异。为了验证结果,采用鸡肝细胞体外培养实验后发现,吡啶甲酸铬全部被代谢,三价铬离子脱离。三价铬离子的分离可能会对DNA结构与DNA复制过程造成负面影响,从而阻止细胞的生长增殖,其可能机理如下:Cr(Ⅲ)可与磷酸骨架(Tsapakos等,1983)、鸟嘌呤、染色体组蛋白(H2AX)(Miller等,1989)、染色体结构维持蛋白(SMC)结合(Timothy,2004),从而影响DNA的复制进程。还可与DNA复制所需的酶类结合,如拓扑异构酶的结合,使DNA松弛活性降低,DNA双链不能完全松弛,导致复制终止;与DNA聚合酶(Tkeshelashvili,1980)、RNA聚合酶(Okada等,1981),翻译延长因子复合体(Wang等,1997)的结合,导致复制、转录、翻译过程受阻。

DNA内链交联(ICL)作为DNA加合损伤的另一方式,占DNA-Cr加合物的10%左右,也可阻止DNA的复制。已有研究报道:ICL可以与鸟嘌呤上的N-7残基(Bauer等,1997),以及与磷酸骨架一定程度的结合,从而物理性地阻止模板DNA的复制(Bridgewater等,1994)。在细胞水平上表现为细胞周期循环中断,甚至导致细胞凋亡、程序性死亡。另有资料显示:Cr-DNA加合物诱导的单碱基的改变通常导致G/C→A/T的转变与G/C→T/A的颠换,同时发现,与铬螯合的配体差异,可导致碱基替代频率发生变化(Quievryn等, 2003;Zhitkovich等,2001)。

4 结语

适宜量吡啶甲酸铬添加对机体代谢有着积极作用,当添加量远高于生理剂量时有可能产生细胞毒性和DNA毒性。在体内研究吡啶甲酸铬的安全性上,除静脉注射途径外,未见毒性报道。在体外研究上,超量添加吡啶甲酸铬(>0.6mM)时可能出现细胞毒性和DNA毒性。其毒性作用与其代谢途径密切相关,但作用机理尚不完全清楚,有待于进一步研究探索。

  

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