爱华网 目 录
实验目的与要求
实验室规则
医学免疫学实验
体液免疫检测
临床常用的抗原抗体反应
实验 一、凝集反应
一、直接凝集反应
二、间接凝集抑制反应
三、ABO血型鉴定法
实验二、沉淀反应
一、双向琼脂扩散
二、单向琼脂扩散
三、对流免疫电脉
四、火箭电泳
实验三 补体结合试
免疫标记技术
实验四 荧光抗体技术
实验五 放射免疫测定
实验六 酶联免疫吸附试验
细胞免疫检测
实验七 T细胞计数
一、E攻瑰花结试验¨
二、Ea玫瑰花结试验
实验八 淋巴细胞转化试验
实验九 移动抑制试验
实验十 T细胞亚群检测
实验十一 白细胞介素2检测
医学微生物学实验
细菌学
细菌形态学
实验一微生物学实验室常用仪器
实验二 显微镜油镜使用法
实验三 细菌的形态观察
实验四 细菌动力显微镜检查法
一、悬滴法
二、压滴法
三、暗视野显微镜检查法
四、相差显微镜检查法
实验五 细菌的染色标本检查法
一、涂片制备及革兰氏染色法
二、抗醛染色法
细菌的生理学
实验六 细菌的人工培养
一、常用培养基的制备原则
二、细菌培养的接种方法
三、细菌的生长情况观察
实验七 细菌代谢产物观察
一、单糖发酵试验
二、VP试验
三、甲基红（MR）试验
四、证基质试验
五、硫化氧试验
外界因素对细菌的影响
实验八 物理因素对细菌的影响
一、温度与细菌生长繁殖的关系
二、紫外线的杀菌作用
买验九 化字因素对细菌的影响
皮肤消毒前后的细菌学检查
实验十 生物因素对细菌的影响
细菌对抗生素敏感性测定
细菌的遗传与变异
实验十一 化学物质对细菌的致突变作用
细菌的感染与免疫
实验十二 病原菌的致病性
一、透明质酸酶的扩散作用
二、破伤风杆菌外毒素的毒性作用
三、鲎试验
实验十三 吞噬细胞的吞噬作用
一、中性粒细胞的吞噬作用
二、单核巨噬细胞的舌噬作用
实验十四 体液的杀菌作用
一、正常血清的杀菌作用
二、溶菌酶试验
实验十五 病原性球菌
一、病原性球菌形态及染色性
二、病原性球菌的培养特性
三、血浆凝固酶试验
四、抗链球菌溶血毒素"O"试验
实验十六 病原性球菌未知标本（脓汁)的检查
实验十七 肠道杆菌
一、肠道杆菌的形态及染色性
二、肠道杆菌的培养特性
三、肠道杆菌的生化反应
实验十八 变形杆菌
一、形态及染色性
二、迁徒生长情况
三、尿素分解试验
实验十九 粪便标本中致病性肠追杆菌的分离与鉴定
实验二十 伤寒、副伤寒皿清学检查
肥达氏反应
实验二十一 需氧芽胞杆菌
一、需氧芽胞杆菌的生物学特性
二、炭疽杆菌的串珠试验
实验二十二 厌氧芽胞杆菌
一、形态及染色特性
二、产气荚膜杆菌"汹涌发酵"试验
三、产气荚摸杆菌动物试验
四、厌氧培养法
实验二十三 白喉杆菌
一、白喉杆菌的形态及染色性
二、白喉杆菌的培养特性
三、白喉杆菌平板毒力试验
实验二十四 分枝杆菌
一、结核杆菌和麻风杆菌的形态及染色性
二、结核杆菌的培养特性
三、肺结核患者痰标本的直接涂片检查
实验二十五 立克次体
一、形态及染色性
二、血清学诊断方法 —— 外裴氏反应
实验二十六 螺旋体
一、形态及染色性
二、暗视野显微镜察钩端蝶旋体的活动力
三、口腔螺旋体涂片与染色
真菌学
实验二十七 真菌
一、真菌形态及菌落特点
二、栈部真菌病临蛛标本直接镜检
病毒学
实验二十八、病毒的形态学
实验二十九 病毒的培养法
一、动物接种法
二、鸡胚培养法
⒈绒毛尿囊膜接种法
⒉尿囊腔接种法
⒊羊膜腔接种法
三、组织培养法
实验三十 腺病毒约分离
实验三十一 病毒血清学试验
一、血凝抑制试验
二、反向间接血凝试验
附录一染色液及染色法
（一） 吕氏碱性美兰染色液配制及染色法
（二）革兰氏染色液配制
（三） 抗酸染色液配制
(四)奈瑟（Neisser)氏染色液配制及染色法
（五）阿尔培脱(Albert)氏尘色液配制及染色方法
（六）冯他那（Fontana)氏渡银染色液配制及染色法
附录二 试剂及溶液
（一）甲基红试剂
（二）吲哚（柯氏）试剂
（三）Hank, s溶液
（四）0.5%水解乳蛋白溶液
（五）营养液
(六）维持液
（七）0.25%胰蛋白酶溶液
(八）PH8·6离于强度0.05巴比妥缓冲液
附录三 常用培养基制备
（一）肉膏汤培养基
（二)普通琼脂（固体）培养基
（三)血液琼脂培养基
(四）半固体琼脂培养基
（五）蛋自胨水培养基
（六）单糖发酵管培养基
(七)醋酸铅培养基
（八）尿素琼脂培养基
(九)Vogel——Bonner基本培养基（简称E培养基）
（十）完全培养基
（十一）组氨酸软琼脂上层培养基
（十二）S·S琼脂培养基
（十三）中国兰琼脂平板培养基
(十四)半固体双糖培养基
（十五）紫牛乳培养基
（十六）泡肉培养基
（十七）吕氏血清培养基
(十八)亚硫酸钾血琼脂培养基
（十九)Elek蛋白胨培养基
（二十）罗氏培养基
(二十一）苏通氏培养基
（二十二)改良沙保弱氏培养基
（二十三）玉米粉琼脂培养基
附录四 真菌小培养法
实验目的和要求
医学微生物学和免疫学实验是医学微生物学的重要组成部分，是医学微生物学和免疫学教学过程中的重要环节之一，是理论与实验研究的技术基础。
通过实验，加深、巩固对理论内容的理解与记忆；学习、掌握有关医学微生物学的基本操作技术，树立无菌观念；更重要的是通过实验培养学生实事求是的科学的态度和独立分析问题与解决问题的能力。为对有关疾病的诊断与防治，对医学微生物学的科学研究工作所必要的实验方法与技术打下一定的基础。特别是通过实验，使学生熟练地掌握普通光学显微镜、涂片染色、分离接种与稀释方法等基本操作技术。
实验形式分教师示教和学生操作两种。前者主要验证理论，后者可从不同角度进行基本技术训练和反复练习，掌握基本技能。
为了提高实验课效果，保证实验课质量，要求学生做到：
⒈实验前必须做好预习，以了解实验的内容、目的、理论依据、操作方法及注意事项，避免或减少错误的发生。
⒉实验过程中坚持严肃性，严格性与严密性，对操作的实验要在全面理解的基础上，按步骤依次进行操作，并进行积极地思考；对示教内容要仔细观察并与有关理论密切联系。
⒊如实记录，分析结果，得出结论。如结果与理论不符，应尽量分析，探讨起原因以培养训练自己的思维能力，最后写出实验报告。
实验室规则
实验中所用材料，多具有传染性（如病原微生物、含病原微生物的患者血、尿、便、痰、脓汁及感染动物等），在实验过程中，必须严肃认真地进行无菌操作，以保证结果准确，防止实验室感染，防止病原微生物污染环境。必须遵守以下各项。
一、进实验室应穿白大衣，不得将书包、衣物等放在实验台上，不必需的物品勿携入室内。
二、实验室内严禁饮食、吸烟及用嘴舔湿铅笔及瓶签等。
三、保持实验室安静，实验进行时不准随意进出。实验室中物品未经许可不准带出室外。
四、如发生感染或污染等意外时，应立即报告指导老师，进行紧急处理。
⒈吸入活菌液，应立即吐入容器中消毒，并用1：1000过猛酸甲溶液或3%双氧水漱口，必要时根据菌类的不同服用适当的抗菌药物。
⒉菌液流洒桌面或地面，倾注2——3%来苏儿或0.1%新洁尔灭于污染面上，30分钟后抹去。手上污染活菌，在上述消毒液中浸泡10——20分钟后，再以肥皂水刷洗。衣服污染时，用上述消毒液浸泡30分钟后，或高压灭菌后清洗。
五、实验用过的吸管、毛细管及玻片等应立即放入指定的消毒液中，不准在实验台上乱放。接种环用后应立即于酒精灯火焰上烧灼灭菌。
六、实验完毕，应及时清理实验室，关好门窗水电，用消毒液洗手后离去。
免疫学检测技术
医学免疫学是当代生物科学中一个极为活跃的分支。它不仅是基础医学的重要带头
学科之一，而且对临床各科都产生了重大影响。随着免疫学理论的进步，免疫学检测技术有了显著的改进和发展，它对探讨临床疾病的发病原理，诊断和防治免疫性疾病，遗传性疾病、肿瘤以及器官移植等具有广泛的应用价值。
免疫学检测技术分为体液免疫检测和细胞免疫检测两大类。
体液免疫检测
体液免疫检测的基本原理是抗原抗体的特异结合反应。主要包括临床常用的抗原抗体反应和免疫标记技术。
一、临床常用的抗原抗体反应
临床常用的抗原抗体反应主要指抗原抗体在体外结合，在适当浓度电解质存在的条
件下，直接出现凝集、沉淀、细胞溶解、补体结合等可见反应。因这部分实验以血清作为抗体材料，所以又可称为血清学反应。
实验一 凝集反应
凝集反应是完整的细菌。红细胞等颗粒性抗原与相应抗体在一定条件下出现凝集物的现象。参与反应的抗原称凝集原，抗体称凝集素。凝集反应包括直接凝集反应、间接凝集反应、间接凝集抑制反应、反向间接凝集反应、协同凝集试验、抗球蛋白试验等。本实验介绍两种方法。
内容：一、直接凝集反应
二、间接凝集抑制反应
三、ABO血型鉴定法
一、直接凝集反应
直接凝集反应是颗粒性抗原与相应抗体直接结合所出现的凝集现象。基本方法有玻
片法和试管法，本实验介绍玻片法。
玻片凝集试验是一种定性试验，方法简便快速。常用干鉴定菌种、测定人类红细胞的AB()血型等。
(一)实验目的与原理
练习玻片凝集试验方法。观察凝集现象，判断凝集结果。
抗原与抗体一般均为蛋白质，在中性或硷性溶液中多表现为亲水性，且带有负电荷。
抗原抗体结合后，由于极性基的相互吸引而变为疏水性，易受电解质影响，如有适当的电解质存在，使其失去一部分负电荷而互相吸引出现肉眼可见的凝块。
(二)实验材料
1、抗体1:10稀释的伤寒杆菌诊断血清与痢疾杆菌诊断血清。
2、抗原:待检病原菌24小时斜面培养物。
3、其它:生理盐水、载玻片、毛细管、接种环等
(三)实验方法
1、取洁净玻片一张，用蜡笔划成三格。标识1、2、3。
2、于1格内滴加1:10伤寒杆菌血清1~2滴，第二格加1:10痢疾杆菌血清1~2
滴，第三格滴加1~2滴生理盐水。
3、用接种环取培养物少许混于第3格中，再取少许培养物分别混于第1、2格中。每次取培养物前接种环均需火焰灭菌。
4、轻轻摇动玻片，1~2分钟观察结果。
(四)实验结果
第3格中应是均匀混浊，无凝集出现。
依被检抗原的不同，在第1或第2格中出现块状凝集。如第1格中凝集，被俭物为伤寒杆菌，第2格凝集则为痢疾杆菌。
二、间接凝集抑制反应
可溶性抗原与抗体结合后不出现凝集。如把可溶性抗原吸附在载体微球上，成为人工免疫微球，再与抗体结合即出现凝集，此称间接凝集反应。由于载体微球增大了可溶性抗原的反应面积，微球上少量抗原存在就足以出现肉眼可见的反应。这种反应的敏感性比沉淀反应高得多。
如先使可溶性抗原与抗体充分结合，再加入有关的免疫微球。因抗体已被抗原结合，不再出现免疫微球的凝集现象。这一试验称间接凝集抑制反应。
(一)试验目的与原理
了解间接凝集抑制反应原理、试验方法与结果判断。
绒毛膜促性腺激素(HCG)为可溶性抗原，在妊娠尿中含量显著增高。如尿中有此抗原存在与相应抗体(抗一HCG)结合后，加入吸附HCG的免疫微球时，不出现凝集现象，呈均匀乳液，如尿中无HCG存在，没有抗原与抗体结合，再加入相应的免疫微球时，即出现肉眼可见的凝集(即凝集未被抑制)。
(二)实验材料
1、妊娠诊断血清(抗——HCG血清)。
2、妊娠诊断抗原(吸附有HCG的免疫微球)。
3、待检尿、正常尿、玻片等。
(三)实验方法
1、取一洁净玻片，用蜡笔划分1、2两格。(图1)
待检尿 正常尿
1、阳性结果 2、阴性结果
2、加被检尿滴于1格内，加正常尿滴于2格内。
3、每滴尿中各加抗——HCG血清1滴摇匀或用牙签混匀。
4、再于各滴中加（HCG乳胶抗原。HCG兔疫微球）1滴;混匀，继续摇动2—3分钟。肉眼观察结果。
(四)实验结果
妊娠尿滴呈均匀乳状，无凝集现象(阳性)。
正常尿滴出现明显凝集颗粒(阴性)。
三、ABO血型鉴定法
血型是根据血细胞表面抗原的差异而将人类血液分为若干类型。红细胞、白细胞、血小板各有自己复杂的抗原系统和血型分类方法，但临床血型主要指红细胞血型而言。
自从1901年Lanlsteiner发现ABO血型系统以来，迄今已发现的人类红细胞血型系统至少有15个，但在临床输血工作中最重要的还是ABO血型系统。
ABO血型系统根据人类红细胞表面A抗原和B抗原的分布。将人类分为A型、B
型、AB型与O型四个血型。不同血型间进行输血时，可因红细胞表面抗原与血清中天然血型抗体结合产生凝集反应，在补体存在时，可发生溶血现象。故临床上给病人输血时，必须先鉴定血型，同时需进行交互配血试验，以复查定型时有无错误或有无亚型存在。
(一)实验目的与原理
熟悉血型鉴定方法及判断结果的理论依据。
ABO血型系统是根据红细胞表面抗原的种类及有无而分为A型、B型、AB型与O
型四个血型。本试验，是依抗原抗体间反应的特异关系，用抗A、抗B两种已知的标准血清(即抗体)分别与被检血混合。根据红细胞有无凝集判定红细胞表面抗原种类，决定是何种血型。
(二)实验材料
1、标准血清:抗A、抗B标准血清。
2、载玻片、采血针、酒精棉、牙签等。
(三)实验方法
1、取洁净载玻片一张，用蜡笔标记“抗A”、“抗B”两部分。分别加滴抗A、抗B血清。
2、用酒精棉消毒耳垂或手指，用采血针刺破，以另一玻片一端的两角取血两滴。分别滴于"抗A"、"抗B"血清中、混匀。
3、前后左右摇动玻片，使之 充分混合，静止10~15分钟。观察有无凝集。
(四)实验结果
凝集者可见红细胞凝集成块，无凝集者细胞均匀分散。
抗A血清抗B血清血型
注：“十”：凝集·“一”：不凝集
实验二 沉淀反应
可溶性抗原(如血清蛋白、细菌培养滤过液、细菌浸出液，组织浸出液等)与特异性抗体结合，在适量电解质的存在下，形成沉淀物，称此反应为沉淀反应。参与沉淀反应的可溶性抗原称为沉淀原，抗体称为沉淀素。沉淀反应的试验方法有环状法，絮状法和琼脂扩散法三种基本类型。其中琼脂扩散法方法简单，用途也较广泛，为本实验介绍的重点。
内容：一、双向琼脂扩散
二、单向琼指扩散
三、对流免疫电泳
四、火箭电泳
一、双向琼脂扩散
(一)实验目的与原理
了解试验方法，观察判定结果。
利用可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂对应孔中各自向四周进行扩散，如抗原抗体相对应，两者在比例适当处，就出现肉眼可见的白色沉淀线。·若同时具有几种抗原抗体系统，因各自的扩散速度不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。
(二)实验材料
1、抗体：甲胎蛋白诊断血清。
2、抗原:肝癌病人甲胎蛋白阳性血清或正常人胚胎组织浸出液，待检血清。
3、1%生理盐水琼脂、载玻片、打孔器、毛细管等。
(三)实验方法
1、将1%生理盐水琼脂加热溶化。
2、制备琼脂板:取洁净载片一片，放一水平台上，将溶化的2·5m1琼脂趁热用吸管注于玻片上，使其自然流成平面，琼脂凝固后用打孔器如图(图2.1)打孔，去掉孔中的琼脂。
图2.1 双向琼脂扩散模式
3、加样:中央孔中加入甲胎蛋白（AFP）诊断血清，1、4孔加肝癌病人阳性血清，2、3、5、6孔加待检血清。加血清至满勿外溢。不可有气泡。
4、加样后，将掠脂板放入有一定湿度带盖容器中，置37℃温箱，24小时观察结果。
(四)实验结果（图2.2）
1、1、4孔为阳性对照孔(加已知阳性标本)，与中央孔间出现乳白色沉淀线。
2、其余各孔与中央孔如出现沉淀线，且一端与阳性对照沉淀线相吻合者为阳性。证明该份血清含有甲胎蛋白。如两条沉淀线相交，表明二者抗原性不同，出现的沉淀线另一种抗原扰钵反应，不能判定阳性。
3、如待检孔与中央抗体孔间末出现沉淀线为阳性，证明待检血清中没有甲胎蛋白。
图2－2 双向琼脂扩散试验结果
2、6孔：吻合沉淀线（阳性）。
5孔：交叉沉淀线（阴性）。
3孔：无沉淀线（阴性）。
二、单向琼脂扩数
(一)实验目的与原理
了解单扩散试验方法、原理及结果分析。
单扩散实验是一种定量试验方法。先将一定量抗体混合于琼脂中，倾注于平板上。凝固后打孔。加入待测抗原。如抗原与抗体一致时，抗原向孔四周扩散，与孔周围抗体形成抗原抗体复合物，呈白色沉淀环，沉淀环直径大小与抗原浓度成正比。如先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，则未知标本中的抗原含量，即可从标准曲线中求出。本试验主要用于检查标本中各种Ig与血清中各种补体成分的测定。
(二)实验材料
1、3%生理盐水琼脂。
2、抗体:免抗人毛Ig抗体血清。
3、抗原:待检人血清、IgG参考抗原。
4、塑料板、吸管、打孔器。
(三)实验方法
1、制备含抗IgG抗体的琼脂板:溶化的3%琼脂、待冷至56℃时吸取1.5ml琼脂与等量适当稀释的抗IgG抗体混合均匀。倾注于水平放置的塑料板上，制成厚薄均匀的琼脂板。凝固后用打孔器打孔二排，每排5孔、孔距8—10mm，孔要圆整光滑。
图3、单向琼脂扩散试验模式
2、加样:用微量加样器加样。
(1)第一排五孔分别加入不同浓度(20、25、50、100、200倍)的参考IgG抗原10μl。
(2)第二排五孔，同法加1:50待检血清10μl，3将琼脂板平放于保持一定湿度的带盖容器内，37℃温箱放置24小时观察结果。
(四)实验结果
标准曲线的绘制及血清标本中IgG含量的测定。
1、以各稀释度标准抗原孔沉淀环直径为横座标，相应孔中IgG含量为纵座标在半对数座标纸上作图，画出标准曲线。
2、依待检血清标本孔沉淀直径，查标准曲线，将查得的唾G含量乘以标本的稀释倍数，即为血清中IgG的含量。
三、对流免疫电泳
(一)实验目的与原理
了解琼脂对流免疫电泳的基本方法、原理及特点。
对流免疫电泳是把双扩散与电泳技术结合在一起的方法。
抗原抗体在电场作用下，各向相反的电极移动。因抗原在PH8.6的缓冲液中带负电荷，由阴极向阳极移动。抗体等电点为PH6~7，在PH8.6环境中带负电荷少，分子又较大，则运动较慢。同时又因电渗作用等原因使抗体向阴极倒退。于是出现抗原抗体相向移动的情况。如二者相应，在相遇的最适比例处即形成白色沉淀线。由于抗原抗体在电场中定向移动，从而提高了试验的敏感性，且沉淀线出现较快，可在一小时内出现结果。
(二)实验材料
1、抗原:甲胎蛋白阴、阳性血清。
2、抗体:甲胎蛋白诊断血清。
3、缓冲液、PH8.6，离子强度0.025——0.05巴比妥缓冲液。
4、1%缓冲琼脂(精制琼脂粉)。
5、电泳仪、载玻片、毛细管等。
(三)实验方法
1、制备琼脂板:将1%缓冲琼脂溶化。吸3m1琼脂倾注于平放的洁净载片上。凝固后如图3孔，孔径3mm，抗原抗体孔间距5mm。
图3、对流免疫电泳模式
2、加样:1、2、3孔加甲胎蛋白诊断血清，4孔加阳性对照血清，5、6号孔均加待检血清。
3、将琼脂板置于电泳槽架上，抗原孔置阴极端，抗体孔置阳极端。琼脂板两端用双层滤纸与缓冲液相连，接通电源，控制电流在3~4mlA/Cm宽(载片宽2.5Cm，应控制电流在10mA)。电压6一10V/cm长，通电1~2小时;
4、关闭电源、取出琼脂板，观察结果。
(四)实验结果
1、1、4孔间应出现白色沉淀线(阳性对照)。
2、2、5孔间出现白色沉淀线(待检血清阳性)。
3、3、6孔间无沉淀线出现(待检血清阴性)。
四、火箭电泳
(一)实验目的和原理
了解火箭电泳试验方法。原理与结果分析。
火箭电泳是把单扩散和电泳结合在一起的方法。抗原在含定量抗体的琼脂中泳动，二者比例合适时，在短时间内形成火箭样或锥状的白色沉淀线，沉淀峰的高低与抗原的浓度成正比。
(二)实验材料
1、抗原。
2、抗体。
3、2%缓冲琼脂。
4、0.05M PH8.6巴比妥缓冲液。
5、电泳仪、载玻片、打孔器等。
(三)实验方法
1、将2%缓冲琼脂加热溶解，保温于56℃水浴中。
2、用0.05M PH8.6巴比妥液将抗体稀释。
3、制板:将二液等量混合，取3m1倾注于平放的载片上。待凝，在载片近端1.5cm处打孔一排共3孔。孔距4mm。孔径3mm。(图4)
图4 火箭电泳示意图
4、用微量加样器分别吸三种不同稀释度的抗原液各加l0uE。
5、琼脂板置于电泳槽架上，抗原孔在阴极端。用两层滤纸与缓冲液连接。接通电源，电流lmA/mm宽或6V/cm长。通电4~5小时。
6、关闭电源，取出琼脂板、观察结果。
(四)实验结果
三孔均出现沉淀峰，随抗原浓度增大，沉淀峰也随之升高。
实验三 补体结合试验
除凝集反应、沉淀反应外，常用的抗原抗体反应还有补体结合试验、中和试验、溶血空斑试验等。本实验介绍补体结合试验。
一、实验目的与原理
了解补体结合试验方法及结果分析。
补体结合试验是一种有补体参与，并以绵羊红细胞及溶血素作为指示系统的抗原抗
体反应。如被检血中有相应抗体存在，则加入相应抗原与补体后。由于抗原抗体形成复合物，可使补体与之结合，溶液中即无游离补体存在。但由于这种结合肉眼不能区别，故需加入指示系统(绵羊红细胞及其溶血素)。如补体已为试验系统抗原抗体复合物所固定，加入指示系统后，因无补体与之结合，则不发生溶血(溶血与否、肉眼易于区别)，是为补体结合试验阳性，表明抗原与抗体相对应。如出现溶血。为补体结合试验阴性。表明试验系统中抗原与抗体不相应。补体末被固定，加入指示系统后。补体与之结合。从而发生溶血反应。
二、实验材料
1、抗原:甲型(或乙型)副伤寒杆菌菌液、2%绵羊红细胞悬液。
2、抗体:甲型(或乙型)副伤寒杆菌诊断血清。溶血素（2个单位/0.25ml)。
3、补体:琢鼠血清(2个实用单位/0.25ml)
4、其它:生理盐水、小试管、吸管等。
三、实验方法：
1、取5只小试管、排于试管架上并注明管号。
2、第1管加生理盐水0.4m1，再用吸管取已灭活(56℃加温30分钟)的抗体血清、lml(或被检血清)加入第一管，吸吹三次使之充分混匀，然后吸出0。25ml放入第2管，两管中的血清均为1:5稀释。
3、按下表所示顺序进行操作。
注：“－”无溶血“＋”溶血
四、实验结果
先观察有无溶血现象，各对照管结果是否正确。
溶血现象:红细胞溶解，混浊液变为红色透明液体;不溶血现象:红细胞未溶解、混浊液不变。
第2、3、4管因缺乏相应待检抗原抗体复合物，故应完全溶血，第5管因仅有羊红细胞和生理盐水故不应溶血。以上均为对照管。
第1管不溶血者为补体结合反应阳性。
二、免疫标记技术
免疫标记技术是用易于识别、检测的标记物如放射性同位素、荧光素、酶等标记已知的抗原或抗体进行的抗原抗体反应，用以检测体内超微量的抗体或抗原。
免疫标记技术保持了抗原抗体反应高度的特异性。当标记的抗体或抗原与待测的相应抗原或抗体反应后，可以不必测定抗原抗体复合物本身，而测定易于识别和检测的抗原抗体复合物中的标记物。通过标记物的放大作用，进一步提高了抗原抗体反应的敏感性，使检测方法的敏感性达到ng~pg/ml水平较常规的血清学方法至少提高敏感性达两个数最级以上。
临床常用的三大标记技求是:酶联免疫吸附试验、荧光抗体技术和放射免疫测定。
实验四 荧光抗体技术
荥光抗体技术即免疫荧光技术，是用荧光素与抗体结合成荧光抗体进行的抗原抗体
反应，是将抗原抗体反应的特异性，荧光素的敏感性，显微镜检查法结合起来的一种免疫学检测方法。
荧光抗体技术的基本方法有直接法，间接法、补体法。本实验介绍间接法。
内容：荧光抗体技术――间接法
一、实验目的与原理
了解实验原理、方法及观察结果。
荧光素具有能和抗体蛋白分子结合并保持抗体活性而仍能和相应抗原形成免疫复合
物的特性，并且借助于荧光显微镜，通过观察荧光素而检测相应抗原。
二、实验材料
(一)器材1、荧光显微镜。
2、37℃温箱。
3、玻片、吸管等。
(二)试剂:
1、抗原。
2、抗体:第一抗体，末标记荧光素的睡IgG。第二抗体:荧光抗体，荧光素标记的抗IgG抗体。
3、其它四PH7.4的FBS缓冲液、甘油缓冲液、丙酮等。
三、实验方法
1、制备含待检抗原的玻片，将待检抗原标本置丙酮中固定10分钟，用PBS缓冲液冲洗。
2、与第一抗体结合：在玻片上滴加第荧光抗体1~2滴，置湿盒37℃保温30分钟，然后以PBS轻轻洗涤3次，凉干。
3、与荧光抗体作用:在玻片上滴加荧光抗体1一2滴;置湿盒37C保温30分钟，PBS洗涤后凉干。
4、封片:在玻片的涂面上加盖玻片，四周滴甘油缓冲液1~2滴封片。
5、立即将标本置于荧光显微镜下观察。
6、对照:同时设阳性与阴性对照，以排除特异性荧光染色攻游离荧光素的干扰。
四、实验结果
根据特异荧光强度判走结果，用加号法表示·标准如下:
（—）无荧光。
（±）极弱的可疑荧光。
（＋）荧光较弱，但清晰可见。
（++）荧光明亮。
（+++--++++）荧光闪亮，且范围广。
实验五 放射免疫测定
放射免疫测定是60年代初期由YaloW和Barson创立的一种体外超微量定量分析方法。它将具有高灵敏度的放射性核素示踪技术与高度特异性的抗原抗体反应结合起来，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、标本用量小、操作简便等优点，应用范围极广，几乎可以应用于一切具有活性物质的测定·目前普遍应用于体液中微量蛋白质、激素、药物等的测定。
内容：放射免疫测定——双抗体法
一、实验目的与原理
了解实验原理及实验方法。
放射免疫测定的基本原理，是标记抗原Ag※和未标记抗原（Ag）对特异性抗体（Ab）的竞争性结合抑制反应。其反应以下式表示:
在以上反应式中，当标记抗原(Ag※)与抗体（Ab）的量保持桓定时，则标记抗原抗体复合物(Ag※—Ab)的形成受未标记抗原(Ag)的制约。如样品中的未标记抗原含量高，则未标记抗原对特异性抗体的竞争能力强，未标记抗原抗体复合物的量就增多，标记抗原抗体复合物的量就相对减少。如样品中未标记抗原含量低·则标记抗原抗体复合物的量就相对增加。标记抗原抗体复合物的形成量与末标识抗原的含量呈一定的逆相关函数关系。
实际工作中，通常先以各种已知浓度的禾标记抗原和一定量的标记抗原及其抗体作用，根据测得的各种末标记抗原标准浓度下标记抗原抗体复合物的放射性结合率·绘制成竞争抑制标准曲线。检测样品时，根据被测抗原的放射性结合率·即可在竞争抑制标准曲线上查出相应的该抗原含量，
图4火箭电泳示意图
图5竞争抑制标准曲线示意图
例如用放射免疫测定（双抗体法）检测乙型肝炎表面抗原。利用125I—HBsAg与乙型肝炎患者血清中HBSAg对特异性抗体的竞争反应，形成抗原抗体复合物，加入第二抗体，复合物板沉淀，而游离的125HBsAg留在上清液中，离心去取上清液，测定沉淀物的放射性·用以表示血清中HBsAg的浓度。
二、实验材料
(一)器材：
1、r计数器。
2、塑料试管、吸管等。
3、37℃温箱，离心机·
（二）1试剂(125J标记试剂盒)
1、H玉·Ag标记液:缓冲液稀释成，00011·，pm扣·1讨.
2、干燥抗HBsAg血清:以PH7.410ml0.05mol/L PBS溶解。
3、第二抗体:羊抗马IgG。
4、稀释液，用蒸馏水稀释至100ml.
5、参考皿清:冻干品 ,以0.5ml蒸馏水溶解。
三、实验方法
1、取6只塑料试管，排于试管架上并注明管号。
2、按下表所示顺序进行操作。
充分混勿后置37℃1小时
四、实验结果
实验六 酶联免疫吸附实验
免疫酶技术是免疫标记技术的一种，是把抗原体反应和酶的高效催化作用原理有机的结合起来，具有免疫荧光技术和放射免疫测定的优点，克服了上述二种方法的缺点的一种新的免疫测定方法。酶标试剂制备容易、稳定、有效期长，敏感性接近放射免疫试验。可肉眼观察也可借助仪器作定量测定。所得结果比较客观。目前，酶标记技术广泛地应用于微生物学、寄生虫学等基础免疫试验及临床免疫实验中。其中，尤以1971年Engvall和Van
Weeman建立的酶联免吸附试验（ELISA）最为常用，ELISA有间接法（测抗体）、双抗体夹心法（测大分抗原）及竞争法（测小分子抗原）三种，以前二法较为常用。
内容：酶联免疫吸附试验——双抗体夹心法
一、实验目的与原理
了解实验方法原理及结果观察与判断。
这是已知抗体测定未知抗原的一种方法。将纯化的抗体结合到固相载体上。加待检血清(欲测抗原)然后加辣根过氧比物酶（HRP）·使之与被固相抗体结合的待检抗原体起反应，最后结合在免疫复合物上的酶遇到相应底物时，使其氧化，从而产生颜色。颜色的深浅与待检血清中抗原量成正比·
二、实验材料
（一）器材：
1、酶联免疫检测仪。
2、37℃温箱。
3、40孔聚苯乙烯板。
4、微量加液器（50ul、100ul）。
（二）试剂:
1、0.05M PH9.6碳酸缓冲液。
2、稀释缓冲液（KCL0.2g，KH2PO4·H2O2.9g，NaCl18g，蒸馏水稀释至1000ml，使用时，加10%免血清。
3、洗涤缓冲液（同稀释缓冲液，但以0.05%Tween—20代替10%兔血清）
4、底物溶液(PH5.0磷酸盐、柠博酸盐缓冲液：将0.2MNa2HPO425.3ml和0.lM24.7m1柠檬酸混合后，加蒸馏水至1000ml，临用前，上述溶液10ml加邻苯二胺4mg，溶解后加入15nl
30%H2O2。
5、2NH2SO4。
6、抗原:HBsAg阻性对照血清及阴性对照血清。
7、抗体，抗—HBs与酶标抗—HBs。
三、实验方法
1、包被：用PH9.6
0.05M碳酸缓冲液将抗-HBs稀释至蛋自量为50ug/ml。在聚苯乙烯板的反应孔中加色0.1ml4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次、每次3分钟。
2、加样：加待检样品0.1ml于上述己包被的反应孔中，37℃2小时。保温后如上洗涤三次。同时做空白对照（空白孔中不加血清），阴性对照（孔中加正常人血清）和阳性对照（孔
中加病人阳性血清）。
3、加酶标抗体，各孔中加入新配制酶标记抗体—HBs(一般1：2000到1：8000稀释0.1ml.37℃保温2小时，保温后洗涤3次。
4、加底物显色：各反应孔中加底物溶液0.lml,37℃保温20分钟。
5、终止反应：各反应孔中加入2NH2SO4。0.5ml.
四、实验结果
肉眼观察:
空白对照与阴性对照孔为无色或接近无色。
阳性对照孔呈深红棕色。
待检样品孔呈色反应即为阳性，
酶联检测仪读取的OD值，可直接作为ELlSA结果报告。
细胞免疫检测
细胞免疫检测的主要目的，是对患者的免疫功能进行评价，以辅助疾病的诊断，疗效的判断及对疾病的预后进行分析。
细胞免疫检测的王要项目包括淋巴细胞数量和功能的测定。
实验七 T细 胞 计 数
体外测走人外周血中T淋巴细胞数量的方法有多种,以玫理花环试验最为简易常用，T淋巴细胞数量的变化与机体的细胞免疫叨能状态有一走关系。临床上多用于某些疾病的诊断及疗效韵观察。
内容：一、E玫瑰花结试验
二、Ea玫瑰花结试验
一、E攻瑰花结试验
（一）实验目的与原理
了解E玫瑰花结试验方法、观察花结形成现象。
人周围血液中T淋巴细胞表面有绵羊红细胞受体，与羊红细泡相遇时，在其周围形
成花环详细胞团，凡能结合三个以上绵羊红细胞者称为E攻瑰花结形成细胞。正常人的
花环形成率为50~70%，大致可以代表周围血中T细胞的百分数。
（二）实验材料
1、淋巴细胞分层液（Ficou）。
2、1%绵羊红细胞。
3、肝素抗凝人血。
4、无钙镁Hanks液。
5、水平离心机。
6、0.8%戊二醛。
7、37℃水浴箱。
8、显微镜。
9、其他。
（三）实验方法
1、取肝素抗凝血1~2ml，用分层液分出淋巴细胞并洗涤，用Hanks液调整细胞浓度为2—2.5×106ml。
2、取小试管加入巴lml淋巴细胞悬液及1%羊红细胞0.l，nl·混匀·置37C水浴箱5分钟。
3、800~1000 r/min低速离心5分钟，放4℃冰箱2小时。
4、轻轻旋转试管使团块混匀，加2滴0.8%戈二醛液，摇匀，室温静置10分钟，使F花环固定。
5、取悬液一滴放于载玻片上，将稀释的瑞氏染液加入玻片上染色3分钟。
6、弃去染液，待干后油镜观察，计数200个淋巴细胞中形成花环的细胞效，算出百分率。
（四）实验结果
1、淋巴细胞染成深兰色，羊红细胞染成淡红色。
2、每个淋巴拙胞上粘附三个以上羊红细胞者即为玫瑰花环形成细胞，
二、En攻瑰花结形成试验(活性E花环形成试验)
（一）实验目的与原理
了解Ea花环形成试验方法、观察现象。
T淋巴细胞中有不同的异质性亚群，他们对羊红细胞有不同程度的亲合力，形成活性E花环的细胞称活性花环形成细胞，它可能是T淋巴细胞中对羊红细胞有高度亲合力的一个亚群，在室温中几分钟即可形成玫瑰花环。活性E花环形成细胞数可能反映机体的细胞免疫水平。凡能结合三个以上羊红细胞者称为Ea玫瑰花环(活性玫瑰花环)。
（二）、实验材料（同E玫瑰花结试验）
（三）、实验方法
1、制备好的淋巴细胞0.1ml(含30万个淋巴细胞)置于小试管中。再各加入0.lml绵
兰红细胞(含600万个羊红细胞)。再各加入0.05ml小牛血清 (最好是五头小牛血清混合后并经羊红细胞吸收过)。
2、混匀后，立即800~1000r/min离心5分钟。
3、离心后，立即将管拿在手中,慢慢旋转、约1分钟左右将下沉的细胞摇匀,但不致使花环散开。
4、向小管中加新配制的0.8%戊二醛溶液0.1ml，轻轻摇匀，4℃冰箱中固定15分钟。
5、取洁净玻片二张，将固定好的细胞悬液全部吸出，轮流滴在二张玻片上、至滴完为止。用毛细管将悬液铺干、待干。
6、用稀释的瑞氏染液染3分钟，弃去染液，高倍镜观察，如淋巴细胞染或深兰色，SRBC呈淡红色时，用水冲去染液，待干后油镜计数。二片共汁400个淋巴细胞，算出形成花环细胞占全细胞数的百分率。
（四）实验结果
淋巴细胞呈深兰色、SRBC呈淡红色。每个淋巴细胞上粘附3个SRBC以上，即为攻瑰花环。但SRBC必须与淋巴细胞膜附着。
实验八 淋巴细胞转化试验
T淋巴细胞受到特异性抗原或非特异性抗原（PHA、PWM和ConA）刺激均能使细
胞发生转化。T淋巴细胞转化率的高低可反映人体细胞免疫功能水平，常被作为细胞免疫功能指标之一。淋巴细胞转化试验可从周围血中分离出淋巴细胞，也可采用全血试验。试验方法主要有形态学方法和3H胸腺嘧啶核甘酸（3H-TdR）修入法二种。前法简单易行，不需特殊设备，本试验介绍这种方法。
一、实验目的与原理
了解淋巴细胞转化试验方法、原理及其临床意义。
T淋巴细胞有植物血凝素（PHA）受体,在体外受刺激后,可发生形态改变而转化为淋巴母细胞。用姬姆萨染色后，计算200个淋巴细胞中转化为母细胞的细胞数（包括过渡型、母细胞和分裂相淋巴细胞），依转比的百分率判定T淋巴细胞的功能。
二、实验材料
1、正常人淋巴细胞（用分层液分出）。
2、培养液：0.5%水解乳蛋白Hanks氏液（含20%小牛血清和青霉素100单位/ml、链霉素100微克/ml）。用5.6%NaHCO3调整PH至7.2~7.4。
3、植物血凝素(PHA)。
4、青霉素小瓶、吸管、载玻片、姬姆萨染液等。
三、实验方法
1、制备细胞悬液:用培养液将淋巴细胞稀释成2×l06/ml，细胞悬液。
2、分装：向两个小瓶中各加2ml，细胞悬液,一瓶加PHA0.1mll(100单位)，另瓶不加作对照。
3、37℃培养72小时。离心沉淀，用Hanks液洗两次。
4、用沉淀推成血片,加姬姆萨染液栗色,镜下观察计数200个以上淋巴细胞，算出转化率。
四、实验结果
对照管转化率1%左右，加PHA之管转化主约为70%左右。
1、成热的淋巴细胞:与外周血中小淋巴细胞形态一致、直径6~8微米，核染色质网
密、无核仁、胞浆略大于核贡轻度嗜碱性。
2、过度型淋巴细胞:直径10一20微米核质密，但有明显核仁。
3、淋巴母细胞，细胞增大，形态不规则，直径20~30微米，核也增大，染色质网纤细有核仁1~2个，胞浆扩大，强嗜碱性可见数个空泡及颗粒。
4、网状细胞样母细胞：细胞增，形态不规则，核淡染有1一2个大小不规则的核仁，胞浆扩大、含空泡，嗜碱性不强有透明感。
实验九 移动抑制试验
正常淋巴细胞受相应抗原或非特异性刺激物作用时，能产生移动抑制因子(MIF)可用巨噬细胞或白细胞作为实验系统中的指示细胞而被检测出米。前者称为巨噬细胞移动抑制试验，后者称为日细胞移动抑制试验，是测定迟发型变态支应的一种常用的体外试验，也是检测细胞免疫功能的一个指标。
内容：白细胞移动抑制试验
一、实验目的与原理
了解试验方法、结果测定及其意义
白细咆移动抑制试验是一种恃异性的体外。免疫试验。体内玫敏淋巴细胞在相应抗原作用下古生多种淋巴因子，其中白细胞移动抑制因子，可抑制白细胞移动。
二、实验材料
1、明胶Hanks液等。
2、细胞培养液，用Eagle液加青霉素200单位/ml，链霉素200mg/ml,20%小牛血清，用5%NaHCO3调至PH7.4即可。
3、抗原或(20~25μgPHA/ml)。
4、干底双孔凹坡片、毛细管、毛细滴管、酒精灯，凡士林等。
三、实验方法
1、白细胞分离
（1）肝索抗凝血3ml(25~30单位肝素/ml)置试管内加3%明胶盐水l~1.5ml
（2）充分混匀后静置37℃45分钟，吸上层血浆和白细胞部分放另一试管。
（3）用4~5倍Hanks液洗三次，第一次2000r/min离心10分钟，后两次1000r/min
l0分钟。
(4)洗后，白细胞用培养液稀释计数，配成1×107/ml悬液(或每3m1血的白细胞加0.1ml培养液温匀即可。
2、用内径0.8mm、长7.5cm毛细管4~6支，各吸白细胞液为营长的4/5。
3、用人焰容封毛细管空端，闭端向下置空试管中·水平离心机2000r/min离心10分钟。
4、在细胞与液体界面用沙轮划痕折断。
5、将含有细胞的毛细管用少量凡士林固定于平底双孔的凹玻片上,每孔二只,排成八字形。
6、试验孔加满含相应抗原(或PHA)的培养液,对照孔加不含抗原。或(PHA)的培养液。
7、用玻片将孔封闭，37℃培养24小时，观察结果。
四、实验结果
计算移动指数，正常值0.8—1.2，移动指数＜0.8时，一般认为有意义。
实验十 T细胞亚群检测
用McAb识别T细胞表面抗原区分亚群，在临床和基础研究中具有重要的意义。
常用的检测方法是间接荧光抗体技术，尚可用荧光激活细胞分类器（FACS）检测。
内容：T细胞亚群检测——间接荧光法
一、实验目的与原理
了解实验原理及常用方法。
不同亚群的T细胞表面有不同的分化群（CD）抗原。用相应的McAb检测T细胞的CD抗原，可以将成熟T细胞（CD3+），细胞进一步区分为CD4+亚群。
二·实验材料
1.抗原：人T细胞表面CD抗原。
2.抗体：OKT3、OKT4、OKT8McAb（第一抗体）。免抗鼠荧光抗体（第二抗体）。
3.淋巴细胞分层液（Ficoll）、Hanks液等。
4.荧光显微镜，离心机等。
5.塑料离心管，微量加样器（50μl、100μl）、吸管等。
三、实验方法
1、取肝素抗凝血2~5ml，淋巴细胞分层液分离淋巴细胞，用Hanks液调整细胞浓度
为1×106/ml。
2、每个离心管加lml细胞悬液2000r/min离心2分钟，弃上清。
3、加OKT抗体，，100μl/管。置4℃45分钟。
4、用含5�S的Hanks液洗涤3次，离心2000r/min，2分钟,弃上清。
5、加荧光抗体，50μl/管。置4℃30分钟。
6、用含5�S的Hanks液洗涤3次，离心2000r/min，5分钟。
7、涂片，置荧光显微镜下计数200个淋巴细胞中荧光阳性细胞百分率。
四、实验结果
正常值为:CD3+细胞60%~80%,CD4+，细胞55~60%,CD8+细胞20%~30。CD4/CD8约为2。
实验十一 白细胞介素2检测
白细胞仟素2(lL-2)是由TH细胞分泌的一种淋巴因子,具有诱导TB细胞增殖分
化、增强NK细胞杀伤活性等多种生物活性。检测机体的lL-2中生水平对临床某些疾病的诊断和基础研究具有重要意义。检测方法有动物细胞检测和CTLL克隆细胞检测两种摹本方法，本实验介绍用CTLL克隆细胞检测IL一2。
内容：IL—2检测
一、实验目的与原埋
了解实验原理及基本实验方法CTLL是克隆化的依赖IL—2的T细胞系。小鼠CTLL也能测定人IL—2。CTLL的增殖速度与培养液中IL—2含量在一定范围内成正比。CTLL的增殖速度可用3H—TaR掺入法测定。先将标准IL—2作一系列不同浓度稀释，求出各相应浓度时CTLL的增殖百分率，作标准曲线，同法作出待测洋品的标准曲线，并计算
IL—2的相对含量。
二、实验材料
1、标准IL—2。待测样品。
2、FCS、RPMI1640培养液等。
3、CTLL细胞株。
4、CO2培养箱、β液体闪烁计数器、多头细胞样品收集器等。
5、96孔培养板、微量加样器等。
三、实验方法
1、用培养液洗涤CTLL2一3次，离心1000r/min,l0分钟。
2、加培养液，将细胞浓度调至1×105/ml.
3、接种细胞于96孔板,100μl/孔。
4、不同稀释度的标准IL—2，100μl/孔，每个稀释度至少3个复孔。
5、加待测样品。不同稀释度的待测样品，100μl/孔，每个稀释度至少3个复孔。
6、将96孔板置平37℃CO2，培养箱内18小时。
7、取出培养板，加入3H—TdR，lμci/孔，37℃CO2，继续培养6小时。
8、细胞培养结束后，用多头细胞收集器将细胞收获在49型纤维滤纸上。
9、将滤纸80℃烘干。β液闪计数器测其cpm。
四、实验结果
将所得数据在半对数纸上画点作图，横坐标为稀释倍数，纵坐标为cpm值，以log表示，将各样品的多数点分别画出回归曲线，计算待测样品中IL—2含量。
细 菌 学
细菌形态学
细菌是很小的单细胞微生物。因其种类多，数量大，在自然界中分布很广，其中一小部分能使人和动植物发病的称为致病菌。从人体、动物体或自然界中分离出致病菌可供传染病的诊断或流行病学分析，这是防治传染病的重要的理论依据。
鉴定细菌种类是一项较复杂的工作，需要进行综合鉴定，但形态特任的观察是关键的一步。因为了解了形态特征。可使分析范围大大缩小，甚至有个别细菌根据形态即可作初步诊断。进行形态观察要解决二个问题：因为细菌很小，需要放大方能观察，因之显微镜是不可缺少的仪器；又因为细菌个体是半透明、反差很小，必须染上颜色才能清楚地观察到真大小、形状，结构及染色反应等特点。
实验一 微生物学实验室常用仪器
本次为参观课，目的在于熟悉微生物学实验室环境及一股的设备情况，并通过实物概括地介绍实验时常用的主要仪器的用途、工作原理及使用时注意事项。
内容：一、显微镜
二、通电冰箱
三、水浴箱
四、恒温培养箱
五、高压灭菌器
一、显微镜
显微镜是医学检验中最常用的一种贵重精密的放大仪器。根据实验的目的要求不同，可分别选用普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。普通光学显微镜
进行细菌形态学检查，普通光学显微镜最为常用。是根据光学透镜成象的原理制成，能将物体放大1600倍。用自然光或灯光为光源，其波长约为0.4μm，在最佳条件下显微镜的分辩率为波长的一半，即0.2μm，而闪眼能看到的最小形象为2mm。故在普通光学显微镜下用油镜放大1000倍，可将0.2μm的微粒放大成0.2mm，能为人肉眼所见，一般细菌都大于0.2μm，在普通光学显微镜下都能看到。普通光学显微镜种类较多，常用的有单筒显微镜、双筒显微镜以及较先进的自带光源和摄影系统的显微镜等。
暗视野显微镜
细菌形体微小半透明，未经染色时与同围对比不明显，在普通光学显微镜下不易看清，如换装上暗视野集光器，此集光器中央不透光，光线只能从周边斜射出来，故背景视野黑暗无光，但斜射到菌体上的光线由于散射作用而进人物镜，到达观察者之眼，因而在黑暗的视野中可看到明亮的被俭物体。
用瞎视野显微镜检查也叫暗现野照明法，这种方法是利用被检物体表面的反射光线和衍射光线观察物体的，所以只能看到物体的存在和运动，不能认清其构造。在暗视野照明下，虽看不清结构，但可以分辨巳0.004μm以上的微粒子的存在。在普通光学显微镜明视野照明下不能看到0·2×0.004μm的微粒,在暗视野照明下可以看到，故暗视野显微镜的分辩率远较明视野照明为高，提高了观察效果,暗视野照明法多用于活细菌和螺旋体不染色标本的检查。荧光显微镜
是以紫外光或蓝紫光为光源,使经荧光素染色的被检标本激发出波长较长的可见光-荧光,在暗视野中显现出荧光闪烁的被检物体,清晰可见,因紫外光或蓝紫光的波长较短(约为0.2lμm)其分辩率得到进一步提高。
荧光显微镜与普通光学显微镜不同之处有以下三个方面，(1)光源，荧光显微镜通常采用功率为，156—200W的高压汞灯为光源，它能发射丰富的紫外光和蓝紫光。(2)滤光片:包括激发滤片和吸收滤片，前者最常用的型号为BG12，国产型为QB24，能产生4950A的蓝紫光。后者与激发滤片配合使用，与BG12配合使用的吸收滤片是OG1，吸收掉不需要的激发光，使所需荧光通过，同时能保护眼睛不受激发光的影响。(3)暗视野集光器。由于背景暗反差大，观察荧光清晰;对放大倍故高荧光弱的标本也能进行观察。
相差显微镜
人的肉眼，只在光波的波长（颜色）和振幅(亮度)有变化时才能看到被检物体。因活的生物体多为无色透明，光波通过时，波长和振幅均不发生变化，故普通显微镜检查很难观察清楚；用暗视野检查也只能看到发光的菌体外形，看不清内部结构。相差显微镜能弥补这两种拉法的不足。其原理是利用被俭物体的光程(折射率与厚度的乘积)之差进行镜检方法。如被检物体与媒质之间，或被俭物体各部分的折射率或厚度不同，或双方都不同，光线通过时引起光相的差异；相差显微镜通过相差板的光栅作用，改变了直接光的光相和振幅，将光相的差异转换成光的强弱的差异使细胞某些结构比其它部分深暗，衬托出鲜明的对此。因此，这种方法不仅不需要标本的染色，还能充分利用物镜的镜日率，是做活体标本检查最好的方法。
电子显微镜
电子显微镜与光学显微镜不同，电镜是利用电子流代替光线，用电子源代替光源，用磁性线固代替放大透镜，即电子流为电子透镜所折射，经过两次放大造成最后的像。电子流波良极短，约为0.05nm，故其放大倍数极高，电镜观察的形象可以投射在荧光屏上显示，也可照相拍摄，还可明磷钨酸负染色，或金属喷涂投影，增加对比度，使图象更具立体感。电镜的电子速度越快，即电压越高，分辩率越小。如在电子流的通路上有游离气体分子，就好象光镜上有尘埃一样，与电子碰撞使其改变通路引起象的散乱，因之，镜简要保持干燥真空状态。故电镜不能观察活的微生物。
二、普通电冰箱
普通电冰箱是实验室最常用的仪器之一，在微生物学实验室中，是用米保存培养基，菌(毒)种、血清以及检验标本等的一种制冷设备。现以封闭式电冰箱为例，加以简介。
封闭式电冰箱在结构上分箱体，制冷系统与电路系统三部分。电冰箱的制冷过程是
质冷剂在密闭的制冷系统中循环，由压缩机将蒸发器内的气体制冷剂吸回，随压缩成高压，高温气体运送到冷凝器:经散热冷凝成为高压液体，经毛细目，节流、压进人蒸发器内，此时液体制冷剂由于压力骤然降低而迅速沸腾蒸发并吸热成为气体，在被压缩机吸回，如此连续工作即形成制冷循环，当箱内温度降至所需温度控制器指示启动通电器切断电路停止工作。
使用电冰箱时应注意
1、电冰箱应放通风处，不受日光照射，远离热源，（电炉、暖气等）以免影响散热，冰箱背面远离墙10cm以上，使空气畅通利于散热。
2、应尽量减少开门次数，箱内物品间应留有空隙，需冰冻保存应置于冰盒内。
3、热物品应冷至室温温度，再放入箱内。
4、蒸发器上结霜不宜过厚，冰霜过厚应及时化霜，以免影响热的传导。
5、电冰箱应保持内外整洁。
三、水浴箱
水浴箱也称水温箱，系由金属制成的长方形箱，箱内盛水，箱底装有电热丝，由自动调节温度装置控制。有37℃和59℃两种恒温水箱，箱盖均呈斜面，使水蒸气凝结水沿边而下，以免水滴落入箱内标本中。
水浴箱通过电炉丝加温，由自动恒温器自动控制，使水浴恒定在实验所需的温度上，为血清学试验常用的设备。
四·恒温培养箱
简称温箱，双名孵育箱，为培养微生物的主要设备，目前常用的为电热式温箱，箱体力双层肤扳中央石棉，前面有圾璃门（内层）和铁门（外层），箱内有数层隔网，箱顶装有温度计。，箱壁装有温度调节箱，箱底夹层中安装有电炉丝串连成电热箱，接通电源，发热器产热，借助温度调节器的自动调节维持箱内的恒定温度。
五·高压灭菌器
高压灭菌器也叫高压消毒锅，是应用最广、效果最好的灭菌器，可用于不怕高温破坏的培养基、生理盐水、废弃的培养物以及手术器械、手术敷料、手术衣等的消毒灭菌，高压灭菌器有手提式、直立式及卧式等多种，但其结构与灭菌原理基本相同，以手提式高压灭菌器为例，简介如下：
手提式高压灭菌器转为一种携带方便的小型灭菌器。其结阔为一金属厚壁圆筒，上万有一金属厚盖，盖周围装有螺旋，借以紧闭锅盖，使蒸汽不至外溢，盖上装有压力表，安全活塞及排气门，锅内有一托架。
使用时锅内加入沸水，放入要灭菌物，加盖紧闭，然后加温至5磅，打开排气门放出冷气，关好气门继续加温至气表指针指15磅温度为121.3℃时，维持15分钟，缓缓放出蒸汽，即达灭菌目的。
灭菌时应注意(1)锅内装物品不应过紧。(2)注意排出冷气。否则气压表虽已达15磅，温度达不到121.3℃。不能保证灭菌效果。(3)灭菌后排气时不能过急，以免容器中液体外溢或引起破裂。(4)不耐高热高压之物品，不能用此法灭菌。
实验二 显微镜油镜使用法
观察细菌形态，需要放大，过去的实验课观察标本时，多用低倍镜、高倍镜放大。观察细菌标本时，必须用放大倍数更高的油镜才能清楚地看到细菌形态特点。因之微生物学实验主要使用油镜。
油镜的特点是前透镜很小，油镜头的标记也因厂牌不同而异，一般多刻有放大率。如(90×，100×)，镜口率(N.A=l.25或1.30),Oil,国产镜头刻“油”字等。
内容：油镜的标记，油镜的使用法
油镜用油的原理，油镜的保护
一、实验目的与原理
熟练地掌握显微镜油镜的使用和维护方法。
油镜可以使标本放大1000—2500倍，研究细菌形态必须用油镜。油镜观察时，在标本与镜头之间必须滴加镜油，否则视野不清。原因是油镜前透镜很小，光线通过玻片标本后在空气中发生折射，进入镜头的光线少，致使视野暗物象不清。如在标本与镜头间加一滴（切勿散开）与玻片折光率(N=l.52)相近的香柏油（N=l.515）则进入镜头的光线增多，视野明亮物象清晰(图1)滴油又能增加油镜孔径数值，提高显微镜的分辩率等。
图1,油镜加香柏油的原理
二、实验材料
普通光学显微镜(以下简称显微镜)
镜油（香柏油)
擦镜纸
被检细菌标本片
三、实验方法
（一）对光：将标本（涂面向上！）置于载物台上，铁将镜台倾斜，以免液体标本和镜油流出。用低倍镜对光，左眼通过目镜观察，用手调节反光镜（天然光源用平面镜，人工光源或光源弱的地方用凹面反光镜），使视野光亮均匀。检查染色标本用强光（将集光器升到最上，光圈完全打开）检查不染色的活体标本则宜用弱光（集光适当下降，光圈适当缩小）。
（二）、调节焦距：
１、于标本上滴加镜油一滴（不要多加！使呈滴状切勿散开），然后用眼从侧面观察，转动粗螺旋，使载物台缓缓上升（或油镜头缓缓下降），至油镜浸入油中接近玻片为止（注意调节粗螺旋时不要用力过猛、过急、以免损坏镜头或压坏标本。）
２、左眼通过目镜观察，同时再缓缓转动粗螺旋下降载物台或上升油镜头，当见到模糊图象时，转动细螺旋，上下调节即可见到清晰的物象。然后一边移动标本片，一边观察，寻找理想的视野仔细观察。
观察标本时，两眼宜同时睁开。减少眼睛疲劳。最好用左眼观察，右眼配合绘图和记录。
（三）显微镜油镜的保护
１、关于显微镜的一般保护法不再重述。
２、油镜用毕，先针油浸镜上提，取下标本片，然后以擦镜纸拭去香柏油，（不许用手、布或其它纸张擦拭。）如油己干可用擦镜纸沾少量二甲苯擦净，并立即擦去二甲苯。因透镜片是用胶纸粘固的，二甲苯能溶解胶质，日久镜片将移位或脱落。
实验三 细菌的形态观察
内容：一、细菌的基本形态；球菌、杆菌、弧菌
二、细菌的特殊结构：荚膜、鞭毛、芽胞
一、实验目的与原理
认识与记忆细菌的基本形态及特殊结构特点。
各种细菌在一定条件下，均维持一定的形态和结构。细菌的形态与结构是鉴别细菌种类的根据之一，细菌结构又与其致病性强弱，免疫发生机理均有一定关系。
二、实验材料
１、显微镜
２、观察标本
（１）球菌、葡萄球菌、链球菌、卡他球菌涂片标本
（２）杆菌：大肠杆菌、枯草杆菌涂片标本
（３）弧菌：水弧菌涂片标本
（４）荚膜：肺炎双球菌荚膜标本
（５）鞭毛：伤寒杆菌或变形杆菌鞭毛标本
（６）芽胞：破伤风杆菌芽胞标本
三、实验方法与结果
在玻片标本的正面，滴加镜油，用油镜观察。
１、注意观察细菌基本形态（１、２、３、号标本），比较其形状、大小排列及染色性。
２、注意六别细菌特殊结构。
（１）观察４号标本荚膜的特点，如大小、颜色与菌体的关系。
（２）观察５号标本鞭毛的特点，如鞭毛的形态，数目及其位置。
（３）观察６号标本芽胞，注意芽胞的形状、颜色及位置。
３、左眼观察标本的同时，右眼将图画在实验报告纸上，并加以适当地描述。
四、实验报告
图示细菌基本形态及特殊结构，并加以适当描述。
实验四 细菌动力显微镜检查法
细菌鞭毛与其动力有关，有无鞭毛，细菌的运动方式不同，依其运动特点可间接有判定细菌有无鞭毛，也是鉴定细菌方法之一。
证明细菌有无鞭毛，除显微镜直接观察其运动特点外，还可以通过鞭毛染色法直接观察有无鞭毛及其特点，也可以通过半固体穿刺培养法间接证明。
本实验介绍的方法中，以压滴法最简单，较为常见。
内容：一、悬滴法
二、压滴法
三、暗视野显微镜检查法
四、相差显微镜检查法
一、实验目的与原理
了解细菌动力的显微镜检查法，观察有鞭毛与无鞭毛菌运动的特点。
有鞭毛的细菌运动称真正运动叫固有运动，其特点是细菌从一个地方游到另一个地方，可以改变位置，无鞭毛的细菌运动叫布朗运动，特点是，不能改变位置，只在局部闪动，是因液体分子的冲击，致使细菌在局部颤动，这种运动也称分子运动。
二、实验方法及实验结果
（一）悬滴法
１、材料
（１）菌种：变形杆菌、葡萄球菌８－１２小时幼龄培养物。
（２）凹玻片、盖玻片、凡士林。
（３）显微镜
图2 悬滴法（正面及侧面）
２、方法
（１）取洁净凹面玻片一张，在凹窝周围涂以凡士林（图２）
（２）取一环变形杆菌或葡萄坏菌培养物，放于干净的盖玻片中央。
（３）将涂凡士林的凹面载物片反转（凹向下），凹窝对准盖玻片的菌液滴置于其上，粘住盖玻片后再反转凹面载片（此时液滴悬于盖玻片下）用接种环柄轻压盖片周围，使与凹窝边缘粘紧。
（４）凹面载片置于镜台上，先以低倍物镜观察（聚光器下降，使视野稍暗）找到液滴边缘后，将边缘移到视野中央，再换高们物镜观察，上下转动微螺旋，即可看到在较暗的视野中有反光较强的闪动或流动的菌体。
３、结果
变形杆菌有鞭毛，有改变位置的运动，即真正运动。
葡萄坏菌无鞭毛，只在局部闪动，即布郎运动。
（二）压滴法
１、材料
（１）菌液同前。
（２）载物玻片、盖玻片、显微镜等。
２、方法
（１）用接种环取菌液置于洁净的载物玻片中央。
（２）将擦净的盖玻片置于菌液上，复盖时，先用盖片一边接触菌液（或先使中央与液滴接触）缓缓放下盖片，防止玻片间产生气泡（否则视野过高影响观察结果）滴加菌液量以得盖片后无菌液溢出盖片为度。
（３）将载片置于镜台上，用低倍物镜找到标本，再换高们物镜观察。
３、结果：同悬滴法。
（三）暗视野显微镜检查法
暗视野显微镜检查主要用于不染色标本的活体细菌、螺旋体等的形态与动力观察，尤以观察活螺旋体较用明视野观察效果更佳。
暗视野检查法是将普通光学显微镜上明视野集光器换上暗视野集光器即可，这种集光器的特点是透镜中间不透光，光线只能从周围通过斜射在玻片标本上。因光线不能直接进入镜筒，故视野是暗的。但斜射到细菌等微粒上的光线，由于散射作用而发出光亮反射到物镜内。故可在黑暗的视野中看到发亮的菌体，如夜空的星星一样，点点发光，极易观察，但不能观察内部微细结构。
1、材料
（1）菌种：牙垢
（2）载物片（厚1.2以下）、盖片（0.16以下）及生理盐水等。
（3）暗视野显微镜（或普通光学显微镜、暗视野集光器和特制镜头）、光源。
2、方法
（1）载片上加生理盐水一滴，用牙签取牙垢少许于生理盐水中混匀，复以盖片。
（2）在暗视野集光器上滴加镜油一滴，然后将次台稍向下移。
（3）将制好的标本置于载物台上，缓缓上升集光器使镜油与载物玻片下面接触，注意切勿产生气泡。
（4）用低们物镜对光，当视野中出现圆形光环时，转动集光器上的调节柄，将光环移至视野中心。
（5）在盖片上滴加镜油，以油镜观察。
3、结果
在黑暗的视野中，菌体光亮，形状清晰，螺旋体的螺旋及运动方式，清晰可见。
（四）相差显微镜检查法
用普通光学显微镜观察活菌（如悬滴法、压滴法），因不能充分利用镜口率，视野亮度降低难于辩别微细结构。用暗视野法，只能观察菌体表面的反射光线，虽然形状清晰可见，但不能观察内部的细微结构。利用相差显微镜观察，上述不足均可避免。因为它是利用光程（折射率与厚度的乘积）之差进行镜检的方法。如被检物体与媒质之间，或被检物体各部的折射率与厚度不同，或二者均不同。即使是无色透明的标本，也能观察其微细结构，因之，本法不仅标本不需染色，物镜的镜口率又得到了充分地利用（不需缩小光栏），这是在视野明亮的情况下，观察活体标本最好的方法。
1、材料
（1）菌种：变形杆菌幼龄（8~12小时）培养物。
（2）相差显微镜，载物玻片、盖玻片等。
2、方法
以国营江南光学仪器厂生产的XS—B1型实验室用生物显微镜用高倍镜检查压滴标本中的不染色活体标本为例。
（1）常法制成标本，置于载物台上。
（2）拆下明视野集光器，换上相差集光器和相差物镜（作相差观察时，选用物镜放大们率必需与相差集光器环形光栏直径相匹配）
（3）在目镜中插入对中望远镜，调节望远镜与物镜间距离，调至能清楚观察到物镜相差环与聚光器环形光栏象，再调动摆动手柄和旋转手轮，使环形光栏与相差环套准。
（4）照明系统调成柯勒照明“黑”形式，在对中望远镜中观察调至灯丝相能覆盖整个环形光栏的光环。
（5）取下对中望远镜，装上目镜，按一般操作法进行观察。
实验五 细菌的染色标本检查法
形态学检查是鉴定细菌的重要一环。但细菌个体小，无色透明，不染色在镜下不易观察清晰，使菌体着色后，即可在镜下清晰地观察其形态特征，有助于菌种的鉴定。
进行细菌染色时因共等电点低（PH2~5），常用美兰、复红、结晶紫等碱性染料，易于着色。
染色方法有单染色与复染色之分只用一种染料使细菌着色的方法称单染色法，用二种以上染料染色的方法叫复染色法，主要有革兰氏染色法、抗酸染色法，此外还有多种特殊染色法。
内容：一、涂片制备及革兰氏染色法
二、抗酸染色法
一、涂片制备与革兰氏染色法
（一）实验目的与原理
初步掌握细菌涂片标本的制备法及革兰氏染色方法。
革兰氏染色原理尚未完全明了，可能与下述三个方面有关：
（1）革兰氏阳性菌等电点（PH2~3）比阴性菌等电点（PH4~5）低，一般染色时深液的酸硷度在PH7.0左右，故阳性菌较阴性菌带有较多的阴电荷，与硷性染料结合力较强，结合的染料较多，不易脱色。（2）革兰氏阳性菌细胞内有某种特殊的化学万分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它与染料——媒染剂复合物相结合，使已着色的细菌不易脱色。（3）革兰氏阳性菌细胞壁通透性低，脱色剂（酒精）较易通过革兰氏阴性菌的细胞壁，将碘和染料的复合物溶解洗出，容易脱色，阳性菌则不易脱色，保留了紫色。
（二）实验材料
1、菌种：大肠杆菌和葡萄球菌的混合液。
2、染液：革兰氏染色液
3、显微镜、载物玻片及接种环等
（三）实验方法
1、染色涂片制备法：涂片厚薄适度，否则效果不好。
（1）涂片：取洁净载物玻片一张，点燃酒精灯，左手持菌液试管右手以持手笔方式拿接种环，在火焰外焰中烧灼灭菌后取混合菌液一环，轻轻涂于玻片的偏中央，涂面直径1厘米左右，厚度适宜均匀（以透过涂面能看清字迹为宜）。接种环于火焰上再次烧灼灭菌后放还原处。
（2）干燥：涂片最好在空气中自然干燥，如欲加速干燥，可将涂面向上，距火焰稍远处烘干，切忌紧靠火焰，以防菌体变形，无法观察。
（3）固定：涂片干燥后，涂面向上在火焰最热部分往返通过三次（一般钟摆速度）即可。固定的目的是杀死细菌，使菌体蛋白凝固与玻片粘附较牢；改变对染料的通透性（一般染料难于进入活细胞内）容易着色。
2、革兰氏染色法
①初染：在已固定好的涂片上滴加结晶紫液1——2滴（以盖满涂面为度），染1分钟后，用水轻轻冲洗。
②媒染：加卢戈液1——2滴，作用1分钟后，水洗。
③脱色：滴加95%酒精2——3滴，轻轻侧动玻片，（以助脱色）使酒精流去，再滴加酒精，如此反复，直到流下的酒精无色或呈淡紫色为止，水洗。
④复染：滴加沙黄液1——2滴，染色30秒，水洗。
⑤待干或用滤纸吸干（一定要吸干！）用油镜检查。
3、实验报告：记录革兰氏染色方法、结果。绘图并进行分析。
二、抗酸染色法
（一）实验目的与原理
分枝杆菌属均具有抗酸性，抗酸染色法主要用于分枝杆菌属染色的一种鉴别染色法。
染色原理一般认为，石炭酸与复红是按分配系数分布于细菌、染色液和脱色剂中。分枝杆菌含脂类较多，石炭酸与染料在菌体内保留的较多。脱色时，溶于抗酸菌细胞内的量也较溶于脱色剂中为多，故菌体保留有颜色，而非抗酸性菌细胞内的石炭酸与染料易离开菌体，不被着色。此外，抗酸染色与细菌细胞壁的完整性也有关系，如因机械作用或自溶而细胞破裂时，抗酸染色性消失。抗酸菌细胞壁能限制染料进入体内，因此染色时须加温，以促进细菌着色。
常用的抗酸染色法是萋一纳氏染色法
（二）实验材料
⒈菌种：卡介苗变形杆菌混合液。
⒉染液：石炭酸复红，3%盐酸酒精，硷性美兰液
载物玻片，显微镜等。
（三）实验方法
1、用卡介苗、变形杆菌混合菌液如前法制备涂片，干燥固定。
2、染色法
（1）在涂面上加满石炭酸复红液，置于金属板上微微加温待蒸汽出现，维持5分钟。（切勿煮沸，随时补加染液，以防烤干。）待冷水洗。
（2）滴加3%盐酸酒精脱色30~60秒钟，轻轻摇动玻片，直至无红色流下为止。然后水洗。
（3）用硷性美兰复染60秒，水洗、吸干后，油镜检查。
（四）实验报告：图示抗酸染色结果。
细菌的生理学
细菌是微小的生物，有其特殊的生命活动规律。在适宜的环境中能迅速地生长、毓，在医学实践中人工培养细菌被广泛地应用于微生物学的理论与技术研究，疫苗的制备、抗生素的生产以及有关疾病的细菌学诊断各个方面。人工培养细菌时除必须具备一定的温度与气体条件外，更重要的是因菌种种类与培养目的不同，需要多种不同的培养基（附录中介绍几种常用的培养基）。细菌在培养基中上的生长现象及形成的代谢产物也因菌种不同而有明显差异。这些生理学特征常作为病原菌鉴定的又一个重要依据。
实验六细菌的人工培养
内容：一、常用培养基的制备原则
二、细菌培养的接种方法
细菌分离培养接种法
细菌纯培养接种法
三、细菌生长状态观察
一、常用培养基的制备原则
（一）实验目的与原理
了解细菌培养基的制备原则和基本程序，熟悉常用培养基的种类与名称。
人工培养细菌时除了需要合适的温度、气体外，最重要的是给细菌提供所需的营养物质，这种营养物的制品称为培养基。
（二）方法
1、培养基的制备原则：
①适当的营养成分。②合适的酸碱度。③配制后经灭菌后方可使用。
2、培养基配制的基本程序
按一定配方称了各种物质→溶解→测定及调整PH→滤过→分装→灭菌、备用。
3、常用培养基的种类；按用途可分为
（1）基础培养基：含有细菌所需要的最基本营养成份，可供大多数细菌生长。最常用的是肉汤培养基与普通琼脂养基。
（2）营养培养基：在基础培养基中加入一些血液、血清等营养物质，可供营养要求较高的细菌生长，如血琼脂平板。
（3）鉴别培养基：利用各种细菌分解的作用物及其代谢产物的不同，可应用含有一定作用物和指示剂的培养基来培养细菌，作鉴别细菌之用，如糖发酵培养基。
（4）选择培养基：是利用细菌对各种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入一定的化学物质，抑制非目的的细菌生长，有利于需要分离细菌的生长，如SS琼脂平板。
（5）厌氧培养基：厌氧菌必须在无氧的环境中才能生长。造成厌氧环境的方法较多，如在培养基中加入动物组织（如肉渣）或还原性化学物质（如巯基乙酸钠、半胱氨酸等），并在培养基表面用凡士林或石蜡封住，使与外界空气隔绝。常用的厌氧培养基有肉渣（疱肉）培养基。
按物理性状可分为：（1）液体培养基。（2）固体培养基，在液体培养基中加入2~3%琼脂，固体培养基倾倒平皿上即成“平板”倾入试管内即可制成“斜面培养基”。（3）半固体培养基：当液体培养基内加入0.2~0.5%琼脂时即成之。
二、细菌人工培养的接种方法：
（一）细菌分离培养接种法——平板划线分离培养法
自然界中，病人被检材料（痰、便、脓汁及病灶）中常有多种细菌混杂在一起，欲证明材料中有无某种细菌存在或专门研究其中某一种细菌时，必须先使各种细菌分散开后，方能获得某种单一细菌的培养物，这种技术称为分离培养接种技术。方法有多种；如平板划线法，平板倾注法及动物接种分离法等，前者最为多用。
1、实验目的与原理
初步练习平板划线分离细菌的方法。使用混杂在一起的细菌分散生长。
将粘有混杂菌材料的接种环，从平板培养基表面的一点开始反复而不重叠地边疆划线，随着划线的延长，接种环上粘有的细菌逐渐减少，至划线的最后部分细菌可单个地留在培养基上生长繁殖，形成单个菌落。
2、实验材料
（1）菌种：白色葡萄球菌和大肠杆菌的混合液。
（2）普通琼脂平板培养基，接种环等。
3、实验方法
（1）右手持接种环在火焰上灭菌待冷（约2~5秒钟）取一环菌液。
（2）左手抓握平板培养基，微开皿盖，伸入接种环将材料涂于培养基“甲”部（图3—1，3—2）。
图3-1平板区划线法图3-2陪养后菌落的散布情况
（3）烧灼接种环冷却后，通过“甲”部左右反复边疆密划线（不重叠）并向下移，至培养基一半的地方如图“乙”部。
（4）再烧灼接种环待冷，将培养基逆时针转90度，接种环通过“乙”部，再划线至培养基所余的一半，如图“丙”部。
（5）如上法灭菌，将培养基再逆时针转90度，通过“丙”部反复划线，划完最后的“丁”部。
（6）划完，盖好皿盖，并在皿底部贴好标签，说明接种者班组、姓名，培养皿倒入，送温箱中培养。
（7）37℃24小时后取出，观察菌落的大小、形状、边缘、表面结构、颜色、透明度等性状。
（二）细菌纯培养接种法
细菌分离成纯种培养后，常需接种至各种有关培养基，以进一步测试其生化瓜等生物学性状。根据培养基的物理状态不同，纯种接种法有斜面培养基接种、液体培养基接种和穿刺接种法三种。
1、斜面培养基接种法；主要用于纯培养及保存菌种。
①菌种：大肠杆菌18~24小时琼脂斜面培养物。
②培养基：琼脂斜面培养基。
（2）实验方法
图4 斜面培养基接种法
①左手拇指、食指、中指及无名指分别握持菌种管与待接种的培养基管使菌种管们外，培养基管位里。斜面部均应向上，管口稍高，以免管底凝固水浸湿培养基表面或沾湿棉
②右手拇、食指先转动两管棉塞，以便接种时易于拔取。
③右手持接种环，烧灼灭菌，柄部也要迅速通过火焰2~3次杀灭表面的杂菌，灭菌后拿在手中，勿与其它物接触。
④以右手无名指与小指拔取菌种管棉塞，再用手掌与小指拔取待接种管，随后将两管管口迅速通过火焰灭菌。
⑤用灭菌后冷却的接种环伸入菌种管，从斜面上挑取不许菌苔，退出管后再伸入待接种管，自斜面底部轻轻向上部蜿蜒划线或在斜面作上下涂布（勿触破培养基表面，沾菌的接种环进出试管时不应触及度管内避）。
⑥接种毕，接种环火焰灭菌后放下。两管口迅速通过火焰2~3次灭菌，先将指掌间棉塞塞入接菌管内，后将无名指、小指间棉塞塞入菌种管上，将管放回原处。
⑦37℃孵育18~24小时，观察生长情况。
2、液体培养基接种法：主要用于增菌培养及检测细菌的生化反应。
①菌种：大肠杆菌18~24小时斜面培养物。
②培养基：肉汤培养基。
（2）实验方法
①如斜面培养基接种法，左手握持菌种管及待接种管。
②接种环火焰灭菌，伸入菌种管取少量菌苔，再伸入肉汤管中在接近上面液面管壁上轻轻研磨（图5）并沾取少许肉汤调和，使菌混于肉汤中。
③接种毕，接种环灭菌后放下。分别塞好棉塞（方法同前）37℃孵育18~24小时，观察生长情况。
图5 液体培养基接种法
3、半固体培养基接种法
制成呈柱形直立于试管中的半固体培养基，应用穿刺法接种。
（1）实验材料
①菌种：大肠杆菌及白色葡萄球菌18~24小时斜面培养物。
②培养基：兰固体琼脂培养基
③接种针
（2）实验方法
①左手握持菌种管及待接种管（方法同前）
②右手持接种针火焰灭菌，挑取少许菌苔，于待接种培养基中心垂直插入（图6）近管底处，然后转动接种针原路退出。
图六 半固体培养基接种方法
③接种毕，接种针灭菌后放下，分别塞好棉塞。37℃孵育18~24小时，观察有无细菌生长，细菌有无动力。
三、细菌生长状态观察
细菌种类不同，在培养基上的生长状态也不相同。通过观察细菌生长状态，有助于鉴定细菌。
1、琼脂平板上菌落观察：一个细菌在固体培养基上，经过一定时间的生长繁殖之后，所形成的肉眼可见的细菌集团，称为菌落。很多菌落连在一起，融成一片，称为菌苔。由于细菌种类不同，以及培养基的成分不同，形成的菌落的特点也不同，可呈现一定的形态、色泽等，有助于鉴别细菌。因此，应当对菌落进行认真观察。其观察要点如下：
①大小：以直径（mm）表示之，1mm左右为小菌落，2——3mm为中等大菌落，3mm以上为大菌落。
②形成：圆形、卵圆形及不规则形。
③边缘：整齐或不整齐、锯齿状、毛发状等。
④表面：光滑、湿润、皱纹、干燥等。
⑤隆起度：扁平、凸起、中心凹陷等。
⑥透明度：透明、半透明、不透明。
⑦颜色：无色、白色、黄色等。
⑧溶血性：在血平板上产生溶血毒素的细菌，可以使培养基中的红细胞破坏溶解，可分为完全溶血、草绿色溶血及不溶血。
根据菌落的特点，可分为光滑型（S型）菌落和粗糙型（R型）菌落。S型菌落为圆型、边缘整齐，表面光滑、湿润。R型菌落与之相反。
2、斜面上生长状态观察：可见有均匀一致的菌苔，如有不同的菌落出现，则表明污染了杂菌。
3、液体培养基中生长状态观察：示培养前的液体培养基多为清彻透明的。接种细菌后，由于细菌种类不同，可有以下三种生长形式。
①混浊：液体变为混浊。
②菌膜：液体澄清，表面有一薄膜。
③沉淀：管底有沉淀物。
4、半固体中生长状态观察：无鞭毛（无运动）的细菌，经培养后仅沿穿刺线生长，培养基清亮。有运动的细菌，沿穿刺线向外扩散，穿刺线摸糊不清，培养基混浊。
四、实验报告
记录普通琼脂平板、斜面、半固体培养基和液体培养基的培养结果。说明有何实际意义。
实验七细菌代谢产物观察
细菌的新陈代谢是由酶完成的，不同种细菌的酶系统不同，分解物质能力及其代谢产物也均有差别。监床上常通过测定代谢产物，借以推定该菌有无特殊酶的存在，以助细菌的鉴定。
内容 ：一、单糖发酵试验
二、V、P试验
三、M、R试验
四、靛基质试验
五、硫化氢试验
一、单糖发酵试验
（一）实验目的与原理
了解糖发酵试验方法及发酵结果的解释。
因不同种细菌具有不同的糖酶，对糖的分解能力不同，对同一种糖有的能分解，有的则不能分解；对糖分解后有的只能产生酸，有的则能产酸、产气。如发酵管变红色（含酸性复红指示剂）证明分解糖后产酸，如倒置小玻管中有气泡出现，则证明产生气体。
（二）实验材料
1、 菌种：大肠杆菌，伤寒杆菌斜面培养物
2、 培养基：乳糖及葡萄糖发酵管
（三）实验方法
１、用接种环将大肠杆菌、伤寒杆菌分别各接种于葡萄糖及乳糖发酵管中（方法同前）。
2、37孵育18~24小时，取出观察结果。
（四）实验结果
注“+”：产酸：+：产酸：产气：“—”：未分解。
二、V、P试验
（一）实验目的与原理
了解通过糖发酵鉴别大肠杆菌与产气杆菌。
细菌分解葡萄糖生成丙酮酸，产气杆菌能使丙酮酸脱羧，生成中性乙酰甲基甲醇。该物质在硷性溶液中被氧化生成二乙酰。二乙酰又与培养基中含胍基化合物发生反应，生成红色化合物，是为VP试验阳性。大肠杆菌不能生成乙酰甲基甲醇，即不能生成红色化合物，VP试验阴性。
（二）实验材料
1、菌种：大肠杆菌、产所杆菌18~24小时斜面面培养物。
2、葡萄糖蛋白胨水培养基。
3、40%KOH溶液（含0.3%%肌酸）。
4、6%——茶酚酒精溶液（促进反应）。
（三）实验方法
1、将大肠杆菌、产气杆菌分别辊接种于葡萄糖蛋白胨水中。
2、37℃孵育48小时，取出后各轩入1毫升KOH和α——荼酚液，摇匀，静置5—15分钟内出现红色者为阳性。
（四）实验结果
产气杆菌培养液呈红色——VP试验阳性
大肠杆菌培养液无色——VP试验阴性
三、甲基红（M、R）试验
（一）实验目的与原理
了解细菌分解葡萄糖后培养基中的最后酸硷度的测定方法，是区别肠道杆菌种类的一个指标。
甲基红是一种指示剂，PH4.5以上显红色。PH5.4以上显黄色。若细菌分解糖后产酸太少或产酸后又不断转化成其他物质（醇醛酮、气体和水等）时，则酸硷度变化不大，培养基显黄色。
（二）实验材料
1、菌种：大肠杆菌、产气杆菌18~24小时琼脂斜面培养物。
2、培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基
3、甲基红试剂
（三）实验方法
1、将大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖蛋白胨水中。
2、37℃孵育２～３天后取出，各滴加甲基红试剂２～３滴，立即观察。
（四）实验结果
大肠杆菌产酸多，培养液PH4.5或更低，呈红色—甲基红试验阳性。
产气杆菌使二分子丙酮酸生成一分子中性的乙酰甲基甲醇，酸类减少，培养液PH较高（PH5.4以上），培养液呈黄色—甲基红试验阴性。
四、靛基质试验
（一）实验目的与原理
了解细菌有无色氨酸酶的测定法，也是区别肠道杆菌的一个指标。能合成色氨酸酶的细菌，分解蛋白胨水中的色氨酸生成靛基质，该物质本身无色，加入对位二甲基氨基苯甲醛时，生成玫瑰靛基质呈红色。无色氨酸酶的细菌，呈阴性反应。
（二）实验材料
1、菌种：大肠肝菌，产气杆菌18~24小时斜培养物。
2、培养基：蛋白胨水培养基。
3、试剂：柯氏试剂（对二甲基酸苯甲醛）。
（三）实验方法
1、将两种细菌各接种于1支蛋白胨水中。
2、37℃24~48小时孵育后，每管各加数滴柯氏试剂，振荡后呈红色者为阳性。
（四）实验结果
大肠杆菌有色氨酸酶，分解色氨酸产生靛基质，培养液呈红色。
产气杆菌无此酶，培养液无色，靛基质试验阴性。
五、硫化氢试验
（一）实验原理
了解检测细菌产生硫化氢的方法
能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，与铅盐（醋酸铅）或铁盐（硫酸亚铁）反应生成黑褐色硫化铅（或硫化铁）沉淀物。沉淀物愈多，表示生成的硫化氢愈多。
（二）实验材料
1、菌种：大肠杆菌、变形杆菌18~24小时斜面培养物。]
2、培养基：醋酸铅培养基。
（三）实验方法
1、沿管壁周围将两种细菌分别接种于醋酸铅培养基中。2、37℃孵育24小时，观察结果，培养基周围呈黑褐色为阳性，证明产生硫化氢。
（四）实验结果
大肠杆菌不能分解含硫氨基酸，不产生硫化氢，醋酸铅培养基周围不变黑色——硫s化氢试验阴性。
变形杆菌能分解含硫氨基酸，产生硫化氢，遇醋酸铅，则沿培养基周围生成黑色的硫化铅——硫化氢试验阳性。
外界因素对细菌的影响
细菌与外界环境的关系非常密切，环境条件适宜，能进行正常的新陈代谢，生长繁殖。条件稍有改变，其代谢活动也可发生相应变化，发生变异，如环境条件改变过于激烈，致使细菌的主要代谢机能发生障碍或菌体蛋白变性凝固，可导致细菌生长受到抑制，甚至死亡。
在医学上常用人工的方法，造成对细菌生长不利的环境，以达到杀死病原的目的。
抑制或杀灭细菌的方法有多种，可分为物理、化学和生物等三大类，实际工作中可根据需要，选用适宜的方法。
实验八 物理因素对细菌的影响
影响细菌长繁殖的物理因素很多：加热、干燥、声波、过滤和辐射等常用于杀菌的有湿热和紫外线。
内容：
一、温度与细菌生长繁殖的关系
二、紫外线的杀菌作用
一、温度与细菌生长繁殖的关系
细菌生长繁殖需要一定的温度，人体寄生菌的最适温度是37℃
（一）实验目的
发解人体寄生菌的生长最适温度。
（二）实验材料
1、菌种：大肠杆菌18～24小时肉汤培养物。
2、培养基：琼脂斜面培养基。
（三）实验方法
1、在三支斜面培养基上，分别接种一接种环大肠杆菌。
2、接种后分别置于4℃冰箱，22℃室温及37℃温箱中，24小时后取出观察。
3、比较三种温度下细菌生长情况。
（四）实验结果
37℃中生长良好。
二、紫外线的杀菌作用
（一）实验目的与原理
了解紫外经理对不同种细菌的杀菌作用及紫外线的穿透力。
紫外线的杀菌波长范围为240—280nm，260nm的作用最强。这部分细菌DNA吸收最多，其伤脑筋用主要是使同一股DNA上相邻的嘧啶通过共价键结全合形成二聚体，影响NDA的正常硷基配对，引起致死性突变而死亡。
紫外线的穿透力很弱，一片盖玻片或纸片能吸收大部分紫外线，阻碍其通过。因之，紫外线杀菌只限于表面的照射。
（二）实验材料
1、菌种：大肠杆菌18—24小时肉汤培养物，枯草杆菌24—48小时肉汤培养物。
2、培养基：琼脂平板
3、灭菌的黑纸片、镊子及紫外线灯等
（三）实验方法
1、取大肠杆菌液数滴，在琼脂平板表面密密涂满整个平板，枯草杆菌同法涂于另一琼脂平面表面，并在皿底注明菌种。
2、镊子经火焰灭菌后，在两个琼脂平板表面中央各放一块黑色纸片。
3、打开皿盖，在紫外线灯下约1m处，受紫外线照射30分钟。
4、用镊子取掉黑纸片，弃入消毒液中，盖好皿盖，37℃孵育24小时，观察生长情况。
（四）实验报告：记录实验结果并进行适当的解释。
实验九 化学因素对细菌的影响
内容：皮肤消毒前后的细菌学检查
一、实验目的与原理
观察消毒剂的消毒效果。
各种消毒剂对细菌的作用机制不同。酚类、醇类使菌体蛋白变性，氧化剂、卤素类、重金属待妨碍某些酶的活力。而肥皂、
去污剂等主要毁坏细胞膜。
二、实验材料
1、2%碘酒，75%酒类
2、琼脂平板
三、实验方法
1、将琼脂平板用蜡笔划线分二部分，注明“消毒前”与“消毒后”。
2、用任一手指在消毒前平板表面，轻轻涂抹，然后用2%碘酒或75%酒精消毒同一手指，干后再于“消毒后”平板表面涂抹。
3、盖好皿37℃温箱培养24小时，观察结果。
（四）实验报告：记录皮肤消毒结果，从中说明什么问题？
实验十 物物因素对细菌的影响
一种微生物的繁殖，而导致另一种微生物受到抑制死亡，这种现象称为拮抗作用，在自然界中普遍存在。其原因，有的是因产生了对另另些微生物的有害物质，有的则因微生物繁殖直接造成另种微生物细胞的破坏而死亡。
内容：细菌对抗生素的敏感性测定
一、实验目的与原理
了解药物敏感性试验方法及实践中的重要意义
抗生素是微生物的一种合成产物，因其有抑菌或杀菌作用，广泛应用于临床治疗。实践证明，有些菌菌对某些抗生素已失去了原有的敏感性（即形成了耐药性），实用中已无治疗价值。为了及时有效地正确治疗，在治疗中均应从病人体内分出致病菌，进行药物敏感性测定，选择最敏感的药物治疗，以提高疗效。
二、实验材料
1、菌种：金黄色葡萄球菌6—8小时肉汤培养物。
2、培养基：普遍琼脂平板。
3、抗生素：含各种抗生素干燥滤纸片（青霉素2单位/片，链、氯霉素，庆大霉素均含10微克/片）小镊子、米尺等。
三、实验方法
1、取琼脂平板二块，用蜡笔在皿底均分四部分，并注明四种抗生素及菌别的标记（图7）
图7 细菌对抗生素的敏感试验（纸片法）
2、用接种环无菌取上二种菌液各两环，置于相应培养基上，用平行划线法轻轻将菌液均匀地密涂于培养基表面。
3、用无菌镊子取上述四种抗生素滤纸片，轻轻贴于两个培养基相应区内，用镊子稍压使之贴紧。（注意！每取一药纸片前，均需将镊子火焰灭菌）。
4、皿底向上放于37℃温箱中，培养18—24小时观察抑菌环直径大小，以判定其敏感程度。
四、实验结果
细菌对药物敏感时，在该药纸片周围无细菌生长（该区称抑菌环）。
细菌对药物不敏感，药纸片周围有菌生长。
一般认为抑菌环直径6—10mm为低度敏感；10—15mm为中度敏感，15mm以上为高度敏感。
五、实验报告：记录抗生素抑菌试验结果并分析它在临床上的意义。
细菌的遗传与变异
细菌与其生存的环境，有着密切不可分割的关系，当环境条件发生改变时，虽然细菌还可能生长发育，但往往会引起细菌基因型改变，而导致新陈代谢的变化。它包括突变和外源性NDA转移与重组。
实验十一 化学物质对细菌的致突变作用
一、实验目的与原理
观察化学药品的致突变作用。
大多数致癌因子有致突变作用，有致突变作用的物质大都是致癌物质，根据药物致突变作用的有无可推测某一药物有无致癌人艇。Ames试验方法较简实用。其原理是以组氨酸缺陷型鼠伤寒杆菌为度验株（如TA15
5，TA1537等），该菌在无组氨的培养基上不能生长，但遇有致突变因子作用时即可恢复为原养型菌，可在无组氨酸培养基上生长，根据形成菌落数量判断其致突变性。
二、实验材料
1、鼠伤寒杆菌（组氨酸缺陷型）完全肉汤培养物。
2、Vogel-Bonner平板培养基（简称E培养基或底屋 培养基）。
3、组氨酸软琼脂上层培养基2ml。
4、含氮芥滤纸片、磺胺滤纸片
5、无菌吸管、镊子等。
三、实验方法
1、将软琼脂加热溶化，并冷却至 45℃备用。
2、用无菌吸管吸鼠伤寒杆菌组氨酸缺陷型菌液0.1ml加热溶化的软琼脂中混匀，并立即倾注于无组氨酸的琼6脂平板，使之均匀铺于表面，静止凝固。
3、用无菌镊子取氮芥，磺胺滤纸片分放于培养基表面。
4、37℃孵育48小时观察结果。
四、实验结果
化学物质对细菌有致突变作用时，滤纸片周围有细菌生长。
化学物质对细菌无致突变作用时，滤纸片周围无细菌生长。
细菌的感染与免疫
细菌的致病性是指细菌侵入机体，在体内生长繁殖，向周围扩散造成组织损伤，引起病理变化的特性。
细菌致病性强弱与其毒力大小相平行的，毒力大小与细菌侵袭力大小，毒素的毒性强弱有密切关系。细菌的荚膜及表层结构和一些侵袭性酶类，是构成侵袭力的物质基础。
人体抗细菌感染的机理有非特异性（天然的）抵抗力和特异性免疫。
天然抵抗力是机体在长期的种系发育与进化过程中逐渐形成的一系列防御功能。这种功能每个人生下来就有，不需预先刺激，也不是专对某种细菌起作用的一种综合性的防御能力。因其生来就有，是由遗传决定的，故称先天性免疫，因其不是针对某一种细菌的又称非特异性免疫，但其又有种的差异，如人对鸡霍乱、蛀对炭疸杆菌均不感受，这种差异又称种的免疫。
宿主的天然抵抗力与特异免疫有密切的关系，它是特异性免疫产生的基础，特异性免疫产生后又能促进或加强天然抵抗力。
天然抵抗力是由机体的屏障结构，吞噬细胞和政党组织和体液中的抗菌物质共同体现的。
实验十二 病原菌的致病性
内容：一、透明质酸酶的扩散作用
二、破伤风杆菌外毒素的毒性作用
三、鲎试验
一、透明质酸酶的扩散作用
（一）实验目的与原理
观察透明质酸酶的侵袭作用
透明质酸酶也称扩散因子。透明质酸是一种粘蛋白多糖，有高度的粘性，在结缔组织细胞间呈“细胞粘合剂”的作用。细胞间的透明质酸被细菌产生的透明质酸酶分解后，细胞间隙扩大，通透性增加，细菌及其毒素易于向周围扩散。
（二）实验材料
1、动物：家兔
2、菌种：溶血性链球菌24小时肉汤培养物滤液。
3、其他：黑色素及注射器等。
（三）实验方法
1、取家兔一只，剪去背两侧部分兔毛，用75%酒精局部消毒。
2、用吸管吸取0.5ml培养物滤液，放入盛有0.5ml黑色素小试管中，另取0.5ml生理盐水混于等量的黑色素小试管中充分混匀。
3、两种混液各取0.1ml分别注入两侧皮内。（注射时注意，勿使黑色素漏出）。
4、注入后立即量两侧黑色素扩散区直径，1小时后再测两扩散区的直径，比较两侧记录结果。
（四）实验结果
混有培养物滤液的黑色素扩散区明显大于对照组扩散区。
二、破伤风杆菌外毒素的毒性作用
（一）实验目的和原理
观察外毒素的毒性作用
外毒素被吸收后，至脊髓前角神经细胞，与神经节苷结合，封闭了脊髓抑制性突触，阻止释放抑制性冲动介质（甘氨酸）。因而阻止了上下神经原之间的正常抑制性冲动的传递，而导致兴奋性异常增高和骨骼肌痉挛。
（二）实验材料
1、动物：小白鼠。
2、毒素：破伤风抗毒素。
3、抗毒素：破伤风抗毒素。
4、其他：注射器、针头等。
（三）实验方法
1、取小白鼠二只，分别喂养于1、2号罐中。
2、给1号小鼠腹腔注射破伤风抗毒素0.2ml（100单位）
3、30分钟后，给1、2号两只小白鼠均经右后腿肌肉分别注射0.2ml1:100稀释的破伤风外毒素。
4、分别喂养，逐日观察有无发病情况。
（四）实验结果
注射破伤风抗毒素的1号小白鼠正常生长。2号小白鼠可见尾部强直，注射毒素侧下肢麻痹，有强直痉挛，逐渐蔓延至另侧或全身，动物于２~3日内死亡。
三、鲎试验
（一）实验目的及原理
鲎试验是检测内毒素的一种试验方汉，试验灵敏，能检出微量（0.0001ug/ml）内毒素.鲎是一种冷血动物,其血细胞(系一种变形细胞)的溶解产物与内毒素相遇,即被凝固,机制尚不清楚,可能是溶解物中含有凝固蛋白原和一种高分子量的凝固酶原,凝固酶原经内毒素激活转化成凝固酶,此酶使蛋白酶原变为凝固蛋白,再通过交联酶的作用,相互聚合形成纤维状凝胶.
(二)实验材料
1、鲎试验试剂一套
2、大肠杆菌内毒素（阳性对照）
3、待检测样品
4、吸管、小试管、试管架等
（三）实验方法
1、将鲎试剂按要求加入等量的溶解水，振摇2~3分钟使之溶解。
2、在试验管中，阳性对照管及空白对照管中各加溶解物（溶解部分）0.ml。
3、试管中加待检液0.1ml，阳性对照管加大肠杆菌内毒素0.1ml，空白对照加溶解水0.1ml。
4、置37 ℃水浴一小时后观察结果。
（四）实验结果
1、阳性对照管出现凝固，空白对照管无变化时，试验结果正确，再观察待检测样品管。
2、试验管出现凝固为阳性，证明有内毒素存在，如未出现凝固，证明无内毒素存在。
心若冰清写于2011.5.19
