爱华网铜绿假单胞菌也称绿脓杆菌，属于假单胞菌属，在自然界广泛分布，对外环
境的抵抗力较强，为条件致病菌，可引起人的眼、耳、鼻、咽喉和皮肤等处感染，
特别是烧伤、烫伤后的感染尤为严重，常使病情恶化，并可引起败血症。该菌为
革兰阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌索为其特征。此外还能液化明胶，还
原硝酸盐为亚硝酸盐，在42℃条件下能生长，可与类似菌区别。
【目的意义】
1．掌握铜绿假单胞菌检测的主要步骤与方法。
2．熟悉化妆品标本的采集原则。、
3．掌握铜绿假单胞菌落的观察和生化反应结果的判断。
【实习时数】
3学时。
【仪器设备和试剂】
1．培养基SCDLP液体培养基、十六烷基三甲基溴化铵培养基、乙酰胺培
养基、绿脓菌素测定用培养基、明胶培养基、硝酸盐蛋白胨水培养基、普通琼脂
斜面培养基。
2．仪器设备恒温培养箱，高压灭菌器，灭菌平皿，灭菌刻度吸管，接种环，
接种针，酒精灯，广口瓶，三角烧瓶等。
【操作步骤、观察与记录要求】
(一)检验程序 34
(二)检验方法
1．样品的前处理
(1)亲水性样品(水包油型)：可取10g加到90ml带玻璃珠的灭菌生理盐水中，
如样品量少于10ml，仍按10倍稀释法进行。如为5ml则加45ml灭菌生理盐水，
混匀后，制成1：10稀释液。
(2)疏水性样品(油包水型)：取样品10g先加10ml灭菌液状石蜡混匀，再加
10ml灭菌的吐温80，在40～44℃水中振荡混合10min，加入灭菌生理盐水75ml，
在40～44℃水浴中乳化，制成1：10悬液。或用均质器，将加有助溶剂、稀释
液的样品放入均质器，均质3～5min后，取上清液待检(上清液的稀释倍数为1：
10)。
(3)膏、霜、乳剂半固体状样品
1)亲水性的样品称取10g，加到灭菌的90ml生理盐水的锥形瓶(内带玻璃珠)
中，充分振荡混匀，放30～32℃水浴中静置15min，用其上清液作为1：lO的稀
释液。
2)疏水性的样品称取10g，放到灭菌的研钵中，加10ml灭菌液状石蜡，研
磨成黏稠状，再加10ml灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70ml灭菌生理盐水，
在40～44℃水浴中充分混合，制成1：10稀释液。
(4)固体样品：称取10g，加到灭菌的90ml生理盐水稀释瓶中，振荡混匀， 35 使其分散混悬后，放30～32℃水浴中，15min后取出，充分振荡混合，再放到
30～32℃水浴中静置15min，取上清液作为1：10稀释液。如有均质器，上述亲
水性膏、霜、乳剂等，可称10g样品加90ml灭菌生理盐水，均质1～2min;疏水
性膏、霜及眉笔、口红等，称10g样品加90ml SCDLP液体培养基，或1g样品
加lml灭菌液状石蜡、lml灭菌吐温80、7ml灭菌生理盐水，均质3～5min。
2．增菌培养 取1：10稀释样品10ml加入90mlSCDLP液体培养基中，置
37℃培养18～24h，进行增菌。如有铜绿假单胞菌生长，则培养基表面有一薄层
菌膜，培养液呈黄绿色或蓝绿色。
3．分离培养 从增菌培养液的菌膜处挑取培养物，划线接种在十六烷三甲
基溴化铵琼脂平板上，置37℃培养18～24h，进行分离培养。此培养基具有较强
的选择性，大肠埃希菌不能生长，革兰阳性菌生长较差，而铜绿假单胞菌则生长
成扁平菌落，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，边缘不整，菌落呈灰白色，菌
落周围培养基常扩散有水溶性色素。也可用乙酰胺培养基进行分离培养，37℃培
养24h，铜绿假单胞菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整齐，菌落周
围培养基略带粉红色，其他菌不生长。
4．染色镜检 挑取可疑菌落，涂片，革兰染色，镜检为革兰阴性杆菌者应
进行氧化酶试验。
5．氧化酶试验 取一小块洁净白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑
取铜绿假单胞菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上加1滴新配制的1％二甲基
对苯二胺试剂，在15～30s之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性；
若培养物不变色，则为氧化酶试验阴性。少数其他菌可能也有颜色反应，但反应
出现较晚。氧化酶试验阳性者，进一步做绿脓菌素实验。
6．绿脓菌素试验 取可疑菌落2～3个，分别接种在绿脓菌素培养基上，置
37℃培养24h，加入氯仿3～5ml，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液
中；当氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移至另一试管中并加入lmol／L的盐
酸lml左右，振荡后静止片刻，如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，
表示被检物中有绿脓菌素存在。如绿脓菌素试验阴性则还要做下面三个试验。
7.硝酸盐还原产气试验 挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种于硝酸盐
蛋白胨水培养基中，置37℃培养24h，观察结果。凡在硝酸盐蛋白胨水培养基中 36 的小倒管内有气体产生者，即为阳性，表明该菌可还原硝酸盐，并将硝酸盐分解
产生氮气。
8.明胶液化试验 取铜绿假单胞菌可疑纯培养物，穿刺接种在明胶培养基
内，置37℃培养24h，取出放冰箱10～30min，如仍呈溶解状即为明胶液化试验
阳性，如凝固不溶锵者为阴性。
9.42℃生长试验 挑取纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放41～42
℃培养箱中，培养24～48h。铜绿假单胞菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单
胞菌则不能生长。
【检验结果报告】
被检样品经增菌分离培养后，在分离平板上有典型或可疑菌落生长，经证实
为革兰阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，可报告被检样品中检出有
铜绿假单胞菌。如绿脓菌素试验阴性，而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生
长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。
【问题与思考题】
1．化妆品微生物检验样品的采集原则是什么?
2．化妆品微生物检验的特点是什么?
3．如何证实化妆品被铜绿假单胞菌污染?
4．化妆品特定菌的概念，种类及其卫生学意义。
铜绿假单胞菌在化妆品中指绿脓杆菌，该菌对人有致病力，可使伤处化脓，引起败血症等。检测方法是《化妆品卫生规范》下面是详细的检测方法：
1.增菌培养：取1:10样品稀释液10mL加到90mL SCDLP液体培养基中，置37℃培养18h～24h。如有绿脓杆菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。
2. 分离培养：从培养液的薄膜处挑取培养物，划线接种在十六烷基三甲基溴化铵琼脂平板上，置37℃培养18h～24h。凡绿脓杆菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素，此培养基选择性强，大肠艾希氏菌不能生长，革兰氏阳性菌生长较差。
在缺乏十六烷基三甲基溴化铵培养基时也可用乙酰胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平板上，放37℃培养24h，绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其它菌不生长。
3. 染色镜检：挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。
4. 氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取绿脓杆菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试液，在15s～30s之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性；若培养物不变色，为氧化酶试验阴性。
5. 绿脓菌素试验：取可疑菌落2～3个，分别接种在绿脓菌素测定培养基上，置37℃培养24h，加入氯仿3mL～5mL，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。
6.硝酸盐还原产气试验：挑取可疑的绿脓杆菌纯培养物，接种在硝酸盐蛋白胨水培养基中，置37℃培养24h，观察结果。凡在硝酸盐蛋白胨水培养基内的小倒管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。
7. 明胶液化试验，取绿脓杆菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置37℃培养24h，取出放冰箱10min～30min，如仍呈溶解状时即为明胶液化试验阳性；如凝固不溶者为阴性。
8. 42℃生长试验：挑取可疑的绿脓杆菌纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在41～42℃培养箱中，培养24h～48h，绿脓杆菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。
检验结果报告
被检样品经增菌分离培养后，在分离平板上有典型或可疑菌落生长，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出绿脓杆菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出绿脓杆菌。
