爱华网蛋白纯化经验指南
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1)我现在手头有个融合蛋白，纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析，之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。
请问有哪些可能会出现这种原因？怎么解决？测过基因序列，没有问题。细胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶剂提取后，可以用GST做亲和层析，但效率只有50～60％左右。洗脱完融合蛋白不需要助溶剂，但这样的条件下切割完后目的蛋白会沉淀，我用0.5％CHAPS助溶可勉强溶解部分，目的蛋白疏水性比较强。
既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇降低极性，这样溶解就会好得多，此外你也直接加2%的PEG这样也降低极性，同时保护你的蛋白，你再做纯化就可以了，我以前遇到这样的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG5000，这样的情况下蛋白还是活性回收率很高，我觉得那些表面活性剂能不用还是不用的好，你失去活性你可以监测一下提取，纯化，酶切到底哪里失去了活性，这样更容易解决你的问题。还有注意缓冲液PH值，看看改变它对溶解度有没有影响。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的浓度降低点，这也是个办法。
2)请问楼主有没有合成过配体为FMN的亲和胶？
亲和的填料合成过20来种,你是希望用它来纯化某种脱氢酶吗,我看FMN可偶联的有限,倒是FAD有活泼的氨基好偶联,何况它们几乎是同一个辅酶,你是不是考虑把FAD连上去.当然FMN的结构上也有个仲胺,可以偶联到带长手臂的环氧活化的填料上,而溴化氰活化或别的活化的介质都不大好,因此我觉得这个没有什么问题.
此外如果是以FMN为辅酶的,那我还可以建议你试试蓝色琼脂糖凝胶,因为它的配基的结构和FMN的三个环很相似,它能纯化不少脱氢酶和激酶.如果它可以你就不需要合成填料了,有现成的.
我已经给你发了相关一些偶联的材料，请查收，现在一般要自己合成亲和填料，有很多公司都提供活化好的介质，自己偶联就可以，其中比较常用的有溴化氰琼脂糖凝胶，环氧琼脂糖凝胶，氨基琼脂糖凝胶，羧基琼脂糖凝胶，活化酯琼脂糖凝胶，以及巯基琼脂糖凝胶等，但是如果是小分子的配基最好选择有3-10碳作为手臂的活化介质为好，此外也曾经有文献报导固定辅酶时，偶联位置不同，选择性有差别，因此你可以选择自己适合的活化介质。
不同的活化的介质对偶联的配基有不同的要求，所以要对自己的配基了解比较清楚就可以选择合适的活化介质。
我一般在合成的时候大多选择环氧琼脂糖凝胶，它能应用的范围广氨基巯基羟基都可以，而且合成的介质刚性好，非特异吸附少，所以不需要特殊处理未反应基团。此外键合的键很稳定，配基脱落少。我觉得是不错的选择。
包涵体的蛋白复性做得不多,但是我记得有个哥们说最管用的办法也是最简单的方法,他说在复性的时候尽量别想什么太高难的技术,那些时髦但不一定好用,常用的有透析复性,稀释复性,包括国外的专家也这么说.我觉得有时候开始摸不出来未必就是方法不行,关键要经常改变条件.
层析复性很时髦,但是真正能用的不很多,我觉得蛋白这东西难就在于大多都不相同,所以关键要多看文献,多琢磨自己蛋白的特性,多尝试。
3)Sephadex G-25（medium）柱脱盐时，盐浓度太高对柱效有影响吗？若有，一般对盐浓度限度如何？
大家别客气，除盐对于浓度应该也是有一定的限制的，同样的样品盐浓度高的自然要比浓度低的要在柱子上走的峰要宽些，相对需要的柱子的分辨率也要高点，但是在正常的范围如1-2M应该影响不大，不过要除得很干净还是尽量少上点样品，我觉得上样的体积毕竟比浓度的影响更大。
4)我的蛋白17kd左右，能跟肝素亲和，一般用离子交换和亲和层析纯化，
现在我用聚乙二醇修饰它，分子量增加5000左右，修饰率不可能达到100％，请问修饰后能用什么纯化方法可以把修饰的和未经修饰的分开？（当然修饰后还残留有聚乙二醇，这个小分子也要除掉）
他们大多用凝胶过滤，我觉得这也不错的做法，毕竟PEG是链状的分子，在柱子上和普通蛋白行为不一样，修饰度越高那么出峰也越后，因此你的蛋白选择sephadexG50试试，它的范围在1000-30000，应该是不错的选择。此外PEG是个疏水性的链，修饰后的蛋白疏水性增强，修饰度越高，疏水性越强，可以用这个原理分离。离子交换也可以选择，因为同样道理，修饰度越高，电荷被屏蔽也越多，电荷也越少，因此应该修饰度越高越先出。亲和也离子交换一样的道理，你可以试试，你手头的亲和能不能分开，你在这几个方法里选择看哪个更经济好用就可以。
5)我是个新手，谢谢楼主给我解决了许多难题。
我有个问题困绕很久，从细菌中提取酶，好象用常规的方法（超声波破壁，缓冲液提取），总是拿不到我要的蛋白。是不是这种蛋白也是疏岁水性较强，需要加助溶剂才能提取出来？另外，我是不是也可以加点甘油或者PEG来提取？
其实这个问题我觉得是这样的，既然你是提取那肯定是有沉淀和上清，你的目标蛋白的分子量你是应该知道的，那么跑电泳先看它到底是在上清还是沉淀里，剩下的问题你再解决如何提取。
对于不同的酶要看酶稳定如何，你可以用不同的PH去提取，我曾经提取一个酶用水就是提取不出来，需要用盐才能提取出来，多试试，设计个方案，这样才能解决问题，所以不一定加甘油就管用，你还得注意破碎本身会不会有问题，倒回去做做也许能找到真正的原因。有什么问题继续探讨。
6)HPLC是用来分析检测or分离纯化？
如果可以用来纯化，上样量那么小有什么意义呢？
如果是用来分析检测，怎样指导以后的分离纯化工作呢？
HPLC既可以做分析也可以做制备，纯化上样量小，这样分离效果好，就可能得到很纯的物质，同时配合质谱等就何以得到很多单一蛋白的特性包括序列等，这些纯度高的组分是用一般的纯化方法做不到的。HPLC重现性好,定量准确,所以也可以用于定量和定性,是分析中不可缺少的工具.
分析出来后如果这个物质很稳定，直接线性放大就可以做大规模的制备，因此摸好了分析的条件也就相应有了制备的条件。
7)利用蔬水性质，用反向HPLC方法分离的原理？（包括洗脱液的选择和谁先被洗脱下来等），请chromatography兄详细点。
反相和疏水都是依据物质的极性来纯化的，极性越强先出来，极性越弱越后出，洗脱疏水是高盐吸附低盐洗脱，反像是极性强的流动相吸附，降低它的极性洗脱，选择主要是依据填料的特点以及样品本身的特点而改变的。
疏水的填料疏水集团密度只是反相的10%左右,其他的都是亲水的,而反相正好相反,它的表面全是疏水基团,因此疏水一般需要高盐吸附,低盐洗脱,反相一般用甲醇水乙睛水吸附,洗脱是逐渐增加有机溶剂的量.由于以上的原因,疏水比反相要温和,蛋白一般不变性,由于填料多为琼脂糖凝胶,所以蛋白回收率高,而反相适合做分析多,也有做制备的,那也是一些分子量相对小的多肽,反相的回收率也低,因为硅胶杂吸附的原因.
疏水色谱是纯化蛋白的另一个有力的工具.
8)求助，我有一段小分子量的蛋白，5KD左右，4对二硫键，诱导表达后以包涵体形式存在，请问，我怎么设计我的纯化步骤？我用过离子交换柱，纯度可以达到60%，但是不知道下边该怎么做？望赐教!
这是我的电泳图谱，第8条泳带的最下边就是我的目的蛋白带，我需要复性，这是一段杀菌蛋白，我要复性之后做抑菌圈。我用的pET-3C的载体，BL21表达
你好，我做复性不多，你可以依据有关有多对4对二硫键的蛋白复性的原理看这方面的文献，我看一般有不少用谷胱甘肽氧化型和还原型配比做的，还有用分子伴侣，你可以多看看再尝试：）
至于纯化，如果你的蛋白有游离的巯基，那我觉得很时候用以前的共价层析，专门对于巯基进行纯化，那填料叫71-7105-00Thiopropyl Sepharose6B不知道现在还有没有这个填料，你可以问pHarmacia公司的人。你pM给我，我可以把这个材料发给你，如果没有，那你只好用离子交换，凝胶过滤，你的既然抗菌，你知道是什么原理，作用于什么部位，和什么结合，那也许可以用亲和的方法，我觉得以前说抗生素有的需要疏水结构，你也可以用疏水试试。同时是包涵你可以先把包涵体溶解，然后降低变性剂的浓度，这样类似分级沉淀，你就可以得到很纯的包涵体，再纯化就容易了，总之我建议你先分级沉淀包涵体，再做纯化。这样省事点。
9)我想用一个短肽（5肽）作配基亲和纯化一个可与它特异性结合的蛋白（67kda），用什么填料比较好，您有什么好的见意？谢谢
对于小分子的配基我觉得需要有一定的亲和手臂，否则由于位阻很难有很好的分离效果，说到活化填料的选择我多说几句，大多人都会选择溴化氰，但是这样做的介质一般杂吸附多，此外没有亲和手臂，所以对于小分子的配基有时候纯化效果不好，此外本身对介质也没有交联作用，所以刚性也差，如果经常用极端pH洗脱配基脱落也多，这是它的一些缺点。
环氧活化的琼脂糖凝胶可以有很多的手臂选择，刚性也好，没有非特异吸附，形成的键比别的活化方法更稳定，因此合成的亲和介质性能更出色，你可以选择这样的方法，偶联很简单，你pM你的邮件给我，我可以把一些材料发给你，供你参考。
10)我目前作的一个蛋白药物的分子量大约是7000，等电点4，目前要去除内毒素有何简单可行的方法？（此蛋白已经纯化好，但检验内毒素不过关）
你用过分子筛吗？superdexG75对你这种蛋白比较合适。做之前请先用1MNaOH1ml/min平衡2小时。这种方法除内毒素，非常有效。
我们以前去除都是用去内毒素亲和的填料直接加到样品中震荡40小时左右,就可以,可以做到<10EU/mg
11)请问HPLC是在蛋白复性后做比较好，还是在HPLC之后再来复性？？？
复性做得不多,柱上的复性更少,但是就感觉而言还是尽量在柱后复性,因为这样好放大,而且容易操作,对于HPLC的柱子很容易因为沉淀而堵柱子,包括很高的变性剂对机器也不好,也可能因为流速慢而结晶堵住管道等,很复杂,虽然有一些这样的例子,但是我觉得真正操作还是麻烦,何况这样做的量也不大.所以还是选择纯化后复性吧.
12)我想问问：我把小分子偶连到填料上纯化其兔多抗，用什么结合缓冲液和洗脱缓冲液好？
我现在拟的是：
Binding Buffer:
20mM Tris,1M NaCl,pH 8.0
Elution Buffer:
50mM 柠檬酸，pH 3.0
应该没有问题,如果挂得不好,你可以把Binding Buffer中的1MNaCl去掉,不知道你用什么活化的载体,如果是CNBr,那就得加,但是我们发现有时候盐也可以洗脱下来东西,你试试再说吧.
洗脱你可以用pH 5.0 4.0 3都试试,如果在高一点就可以洗下来,没有必要用太低的,怕对活性有影响
13)这段在用离子交换柱纯化蛋白，我想问一下，洗脱采用的离子强度的大小范围，应该如何确定，可以根据什么来调整洗脱时的离子强度
一般采用的盐浓度的范围在0-2MNaCl之间，怎么确定得配合你的洗脱的峰的电泳结果来确定，最直接的就是你的目标蛋白，如果在很早就出来，那你洗脱的盐浓度（离子强度）就不用太大，如果出来的很晚或一直没有出来，那就选择更高的盐浓度。
当然你也可以选择用阶段洗脱的方法，这样比较容易放大，分离效果其实也不错，虽然摸索要麻烦点，但是重现性好，也一样可以做得很纯，而且能很精确知道在多少浓度下洗脱出来。我比较喜欢用这种洗脱方法
14)你好：我有一个困惑了好长时间的问题，想请教。我的蛋白是2KD，在做非还原电泳时，发现除了目的蛋白外，有二聚体和多聚体存在。目的蛋白占44%，余下大部分为二聚体和多聚体。但在做反相HPLC时，只出现两个峰，第一主峰占90%（目的蛋白的位置），出峰时间为13分钟，第二主峰占10%，出峰时间为3分钟。请问在做HPLC时，二聚体和多聚体是否发生改变？用此方法测定含有二聚体和多聚体存在的目的蛋白纯度，是否不妥？我用柱子是C4柱，5υm,300埃。流动相B用0.05%三氟乙酸的乙腈，流动相A用0.05%三氟乙酸的纯水。
我觉得蛋白的聚合应该和存在的环境有很大的关系，但是即使如此，那聚合体在反相上能有这么大的差别吗，你可以用HPLC的凝胶过滤柱子在走一遍试试，或者你把第一个峰和后面的峰都跑电泳看是不是都是蛋白，如果第一个峰也是蛋白，那说明你推断是对的，如果不是，那就是没有分开。
我觉得测定聚合体还是用高效凝胶过滤色谱更好点，非还原电泳也应该不错，反相你可以查查文献有没有这么检测的。
目前检测protein aggregation的方法主要有四种。
1。gel filtration.根据专门的mark，可以推断大致的聚合物的分子量，不过实际应用上看，影响的因素太多了，结果很不精确。
2。native gel. 大致上可能可以推断聚合的程度，不过结果实在不能让人信服。通常要与其他结果配合说明问题。
3。Dynamic light scattering：简单方便，结果可信，常用于挑选蛋白结晶的条件。但是对于浓度有限制。
4。超高速离心。
文献中多见1，3联用，3 explains the status of protein, and 2 explain thestatus of concentration-dependent aggregation.
有时也见过1，2联用的，不过仅用于说明次要问题。
15)请教阁下：我想把一种配基连接到环氧活化的琼脂糖上制备亲合介质，但是这种东西在一定比例的有机溶剂（如二氧六环）和水混合溶液中才溶解，似乎看过文献提到，有机溶剂会影响琼脂糖，不知如何处理这个问题？谢谢。
完全没有问题，因为有些琼脂糖凝胶活化时就在有机溶剂中，所以它们本身不会影响到活化后的琼脂糖的，相反在有机溶剂中环氧基团更不容易开环。所以你不用担心，你的配基稳定的话你可以用0.1MNaOH溶液混合你的有机溶剂室温偶联24小时就可以。
16)最近我在用sephadexG-75的胶纯化蛋白，总共膨胀了3次新胶（其中第一次是一个批号，后两次是同一个批号），第一次是90度9个小时，加BSA4度过夜，第二次是按照安玛西亚上的时间90度3小时，还放在120度高压锅内灭菌，没有加BSA，第三次同第一次做法，结果发现，第一次的胶一开始的流速很快，根据说明书上给的线性流速可以达到37cm/h，而且分辨率很高，但后来两次，线性流速最快的时候也只有17cm/h，分辨率低得多，不知道是什么原因？？？？（我们用的玻璃管都是一样的型号）
这都很正常的处理应没有问题,但是还放在120度高压锅内灭菌不知道行不行,此外你用什么液体处理的填料呢,pH是在中性吗,在酸性和碱性条件下有可能会使结构破坏的,你可以测定一下.如果pH没有问题,那应该说填料本身没有问题.至于流速你的样品会不会比较粘,你柱压高不高,如果柱压高,那填料变形压缩,那流速自然慢,而且分离效果不好,你的样品会不会有核酸或多糖,这样会影响的,因此你还是看看柱床体积有没有变化,如果缩小很明显,那你就重新装柱子.
17)我们用c-18反向柱纯化蛋白，用的流动向是1%三氟乙酸，乙腈，不知道这两种东西，在什么浓度对蛋白有变性作用。
反相一般都是做分析的多,除非你的蛋白很稳定,否则不大适合做纯化,因此在有机溶剂中都有变性的可能,一般10%左右短时间应该没有问题,高了就很难说了,当然这也很蛋白本身关系很大,如果你真的想纯化,那建议还是改C3或C4这样温和点,你的有机溶剂也不需要很高的浓度就可以洗脱,也许会好点,你可以配合你的活性测定找到一个合适的浓度使你的蛋白活性回首率更好,纯化过程一定要快这样也降低变性的可能.
18)我有一单抗腹水，第一次纯化时，我先用50％硫酸铵沉淀，然后上HiTrapdesalting脱盐，再过MonoQ强阴离子交换柱，用IFA检测抗体活性，合并收集峰，最后进行透析。第二次纯化时，是直接将腹水上脱盐柱，没有经过硫酸铵沉淀，结果两次纯化结果，第二次所的蛋白浓度是第一次的三倍多，纯化的抗体我主要是用来做胶体金标记，请问两种纯化过程，对抗体的纯度会有什么影响，是否会对标记效果产生差别？
腹水中应该有一些脂溶性物质以及一些别的杂质,沉淀后应该更干净点,直接过柱子要注意清洗,至于这两个方法具体效果如何,你可以跑电泳检测,同时也可以做抗体的活性检测,如果没有什么差别,那当然是回收率越高越好.具体怎么样只有检测后才知道.
19)用HPLC分析得到的结果对我们用普通的层析柱纯化有什么指导意义吗？
我觉得有意义如凝胶过滤的柱子,那可以知道分子量的分布以及别的信息,而如果是反相可以知道哪个蛋白的疏水性强,用离子交换的柱子可以知道电荷的不同,总之了解的信息越多对纯化越有用,所以说都是有意义的,只是很少有先做HPLC后做纯化的,大多先纯化后用HPLC分析.
20)离子交换层析，一般用氯化钠洗脱，可以用氯化钙洗脱吗？
没有问题,是盐都可以,只是小心钙离子容易和磷酸盐产生沉淀,你可以用别的缓冲液就没有问题.
21)我想请问高效凝胶过滤色谱柱那种比较好，用什么流动相，PH 多少为好？目的蛋白是2KD。
别客气，其实高效凝胶柱子一般用TSK系列的最多，你可以看看有没有分离范围窄点的柱子，只怕难有分离范围这么小的凝胶柱。流动相用缓冲液就可以。其实按你的分子量，用反相例如C3或者C4更合适，你也可以直接用C18的试试试，凝胶柱很贵，如果用不了那不是可惜了。
补充一下，由于分子量小，可以用MS来估计disulfidebond是否形成。形成一个，分子量减少2（失去两个proton）。
至于复性，建议在纯化之后进行。有文献证明，蛋白复性，成功的可能随纯度的提高而提高
因为HPLC用的填料一般是5-10um的,而通常用的填料至少也在35um以上,分离效果差别还是很大的,如果要把这么细的填料装在普通的柱子上,压力很大,一般的泵和系统,包括柱子根本承受不了那么大的压力,此外普通的层析系统的泵的精度管道等都很难保证有很高的分离效果,但是你可以把HPLC的条件直接用普通的填料来放大制备,例如你摸好了HPLC的反相或者亲和以及离子交换的填料,如果它们有相应的颗粒大的普通的填料,那就可以直接用HPLC上的条件,这样只要你HPLC的条件很好,那就可以,但是高效凝胶过滤色谱难在普通的柱子上放大,它也没有相应的填料.
22)你所提及的样品如含有核酸或多糖会影响sephadexG-75柱的流速及分辨率,具体何解？
我觉得是这样的：凝胶过滤的原理是小分子能进入的孔到多于大分子的，但是如果有多糖或核酸的干扰（很粘），这样一些小分子也不能进入更多的孔（和没有干扰的相比），这样自然分离效果不如没有干扰的。这是其一。
其二是由于这些东西粘度大，那么同样流速下，由于sephadexG-75压力比平常的大，所以胶会压缩变形，这样它的内孔和没有干扰的排阻极限也不同，所以分离效果自然比没有干扰要差。特别是压缩会使孔变得不均匀。
当然相对而言，前面的原因是最主要的，后面是次要的。
其实不仅是凝胶过滤，别的色谱有这两物质（还有一些脂溶性的物质）也会一样干扰传质，因此影响分离效果。所以这两个东西一般要小心，同时它还会降低柱子的寿命。
23)我的目的蛋白是以可溶形式表达，MW=６KD,理论等电点为9.45．，无tag．我先用S-100除去了部分杂蛋白，但接着再用阳离子交换柱SP分离（２０mMPBph=7.00），发现目的蛋白根本挂不上．我想试用硫酸铵分级沉淀除去部分杂蛋白，再过s-100.但不知硫酸铵分级沉淀该如何具体操作？
你可以先把缓冲液pH调到6试试能不能挂柱，此外其实你的蛋白分子量很小，杂质应该大多分子量比它大，你直接过sephadexG50那么大于30kd的很快就出来，或者上superdex 30大于10KD的先出来，而你要的在后面，然后你再用离子交换试试，S-100分离范围比较宽，去杂质没有前面说的那两种好，此外你凝胶过滤后可能含盐那也挂不住，因为这样小的分子盐会和蛋白一起出来的，你测定样品的电导看看。
硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，你可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，你可以设计你的实验，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。
24)如果怀疑是多糖造成的黏度过大，请问应该如何去处多糖？
多糖去除你可以用硫酸铵分级沉淀,也可以用低温乙醇分级沉淀.一般的多糖也不带电荷,你可以用离子交换挂住你的蛋白,这样也是可以的
25)问一个有关DEAE Sephadex A50的问题，我的填料处理好后别人拿去用了，用了一次，结果我把他放到烧杯后，发觉已成絮状，不知有没有坏掉？可以再用吗？用什么方法可以把它恢复到原状？
这个絮状的东西有颜色吗，会不会是染菌了，或者是脏的东西没有处理干净，你可以用0.5MNaoH泡半小时，沉淀后倾去上清，做三次这样的处理，如果还有不干净的东西，你可以用6M盐酸胍泡半个小时，然后处理和NaoH一样，再换水，这样你看能不能洗回来，如果不能很好沉淀下来，那就不能用了。凝胶类的填料很容易长菌，用完得洗干净，保存在20%的乙醇中。
26)我想在想纯化peg修饰的蛋白，可是我目前只有弱阳离子交换的羧甲基纤维素，你看能不能纯化阿，好像文献上都用sp-sepharose，纤维素是不是不行啊？另外，目前没有专门的层析装置和蠕动泵，我用普通的层析柱是不是就可以阿，流量是不是也不用太精确阿？谢谢！
离子交换的方法是可以的，但是我觉得疏水也很值得一做，因为修饰后电荷变化了，其实疏水性也增加了，所以这些方法都可以，此外只要你的CM纤维素能挂住就可以分离，，SP-sepharose只是更强点，而且流速更好点，你先试试，不行再换吧。没有蠕动泵纤维素流速会比较慢吧，流量肯定不精确，我觉得还是有个泵好点，没有检测器也不行，这些是纯化的基础，要不可是比较麻烦的，怕实验难重复。何况你没有泵也没有办法做线性剃度洗脱。反正是太简单点。
27)问一个有关DEAE Sephadex A50的问题，我的填料处理好后别人拿去用了，用了一次，结果我把他放到烧杯后，发觉已成絮状，不知有没有坏掉？可以再用吗？用什么方法可以把它恢复到原状？
这个絮状的东西有颜色吗，会不会是染菌了，或者是脏的东西没有处理干净，你可以用0.5MNaoH泡半小时，沉淀后倾去上清，做三次这样的处理，如果还有不干净的东西，你可以用6M盐酸胍泡半个小时，然后处理和NaoH一样，再换水，这样你看能不能洗回来，如果不能很好沉淀下来，那就不能用了。凝胶类的填料很容易长菌，用完得洗干净，保存在20%的乙醇中。
28)首先我想问一下agarose和sepharose区别,我的理解是:都指琼脂糖,但agarose是未连接其他介质的,而sepharose是连接其他介质的,不知理解对不对?请指教!Glutathione-agarose(4%cross-linkedbeaded agarose)和Glutathione Sepharose 4B是一种东西吗?
其次,我想问一下你纯化过GST融合蛋白没有?我现纯化一个融合蛋白(某种酶和GST融合),我买了SIGMA公司的GLUTATHIONE-AGAROSE五毫升,但我不知怎么做.分子克隆说直接将亲和介质于细菌裂解液混允离心....我不知我买的可不可以这样做.而产品说明书上说做柱子,我就想1毫升的柱子怎么做,装介质的柱子的高度和直径有要求吗?
agarose是通常的琼脂糖的英文名称，大家都这么叫，它不是商品的注册名称。而sepharose是amersham的琼脂糖凝胶的注册商品名称。所以你理解是有偏差的，此外agarose不一定是琼脂糖凝胶，而Glutathione-agarose(4%cross-linkedbeaded agarose)和Glutathione Sepharose 4B是同一类东西，只是厂家不同。
GST融合蛋白纯化过，5ml的凝胶你可以装在1.6x20的柱子上用，也可以按照分子克隆的做法做，取决于你的喜好和方便。1ml不好装，除非有专门的小柱子，对于直径和高度没有特别的要求，我们的做法是：
1、GST琼脂糖凝胶FF装柱，0.7X2.5cm，柱床体积为1ml；
2、用缓冲液1平衡5个床体积，流速为1ml/min；
3、将10ml发酵液用缓冲液1稀释到20ml，0.45μm滤膜过滤，上样。流速为1ml/min；
4、用缓冲液1再洗10个床体积，流速为1ml/min；
5、用缓冲液2洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰
6、用纯水洗5个柱床体积，再用20%的乙醇洗5个柱床体积，流速为1ml/min，柱子置于+4~8℃环境中保存
缓冲液组成：
缓冲液1：20 mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.2 M NaH2PO4 19ml，0.2 MNa2HPO4 81ml加水至1000ml。
缓冲液2：50mM Tris-盐酸缓冲液，pH8.0，配制：0.1M Tris 50ml，0.1 M盐酸29.2ml，307mg还原型谷胱甘肽，加水至1000ml。
29) 请问conA sepharose 4B 亲和凝胶使用前的处理方法？
不需要特别处理，直接平衡后就可以上样了。
30)谢谢，我想问一下，是不是离子交换必须要线形梯度洗脱比较好呢？还是阶段洗脱好？检测器我想先收集然后再去测紫外。
也不是,有的时候阶段洗脱效果就很好,而且容易放大,不需要仪器,我比较喜欢,效果差不多,但是很省事.但是关键是容易重复.紫外分管测定那也可以,我上学也那样做过.
31)我要从总蛋白中提出250KD的NF1蛋白做western，由于量少所以要做免疫沉淀。我是利用小鼠来源的NF1单抗与兔抗小鼠IgG、proteinA－sepharose来做免疫沉淀，发现做完后跑电泳，出现了两条带，分别位于85KD、55KD左右，请问这会是什么东西？会是抗体吗？还有没有可能是目标蛋白变小了？
抱歉,我没有做过免疫沉淀,但是抗体做过一些,抗体重链没有大到85KD的地步,所以应该不是抗体.会不会你的蛋白有四个部分构成,分别是两个85KD和55KD,这样分子量正好和你的250KD相当,你可以跑非还原电泳看看,是不是还这样呢.如果不是,那说明是由这两个部分组成的.都是由二硫键连接的.
32)我提胰蛋白酶，主要参考用张龙翔书里的办法，先提卵类粘蛋白，首先过SEPHADEX G-25柱子脱盐，然后过DEAE纤维素离子交换柱；第二步是用卵类粘蛋白合成SEPHAROSE-4B亲和柱。这些层析过程都可以在缓冲液里面加0.02%的叠氮化钠抑菌吗？以后怎样去除？
我提胰蛋白酶粗酶用的乙醇，可以用异丙醇或正丁醇或其它的低分子醇吗？浓度多大为好？
那实验我知道，你用什么方法活化琼脂糖呢，胰蛋酶的亲和纯化方法很多，配基有大豆胰蛋白酶抑制剂，抑肽酶，苯甲脒类，特别是后面的苯甲脒，可以买到现成的苯甲脒琼脂糖凝胶，何必自己去提取呢，感觉比较复杂，自己偶联这些配基也可以，层析过程不需要加0.02%的叠氮化钠抑菌，尽量不要加，那透析或者除盐柱子都可以，或者直接上一样的亲和柱子，用不含这个的缓冲液洗，最后洗脱下来就可以了。
最好还是用乙醇，浓度很难说，因为和你的蛋白浓度有关，别的醇用得很少。此外你可以考虑用硫酸铵沉淀，这样对活性更好些。纯化也可以用疏水，因为它在苯基琼脂糖凝胶柱子上能被吸附，配合硫酸铵沉淀也是不错的选择。
33)楼主,我想问一下phenyl-sepharoseCL-4B有没有浓缩作用,以前有人做过,克也在纯化时,浓缩5-10倍,可是,我却没有使纯化的蛋白浓缩,我想得到浓度较高的蛋白,又想省去浓缩这步,楼主能不能指点我一下,缓冲液的流速以及柱子的选择上有什么要求,使洗脱下来的蛋白浓度会较高,
亲和，疏水，离子交换都可以浓缩样品，但是离子交换是最便宜的，苯基可以浓缩，但是想有好的浓缩效果，最好用一次洗脱或者阶段洗脱的方法，我建议你先用离子交换柱子挂住，然后直接用高盐洗脱，因为不知道你蛋白的等电点，所以不知道你该选什么柱子。如果样品含盐高，那可以用疏水，然后直接用缓冲液洗脱就可以。亲和也差不多这样的。流速没有太大的要求，柱子看你手头有什么，离子交换是最常用的。上点样
34)我做的是青霉素酰化酶,样品盐浓度很高,我是两步纯化,第一步使用氧化铝物理吸附,使用含有1.7mol/L(即200g/L)硫酸铵的ph7.5,0.05mol/L的磷酸缓冲液洗脱的.第二步想用phenyl-sepharoseCL-4B脱盐和浓缩,可是效果很差,基本是起不到浓缩的作用.
我做了好几次,都是这样,可是前面有人做的时候起到浓缩的作用,我现在却做不出来,也联系不上以前做过的人.
phenyl-sepharoseCL-4B使疏水层析,我现在就这种柱子,我想问的是装填料的时候用的玻璃柱株高和直径的比值大的还是小的,洗脱蛋白时会使洗脱的蛋白峰值高一些,谢谢
这个酶纯化应该可以用亲和的方法做吧,其实只要把青霉素G偶联到琼脂糖凝胶上就可以特异用于这个酶的纯化.苯基琼脂糖凝胶浓缩可以,但是除盐不好,你想浓缩效果好,你可以把硫酸铵的浓度提高到2.5M再挂在柱子上,直接用ph7.5,0.05mol/L的磷酸缓冲液洗就应该可以.你想浓缩的效果好,那尽量用短粗柱子,也就是径高比大的柱子.这样扩散少些.此外要用高载量的填料,颗粒细点,起始盐浓度高点,这样保证能浓缩好你的样品.
35)楼主：这段在用离子交换柱过抗体，请问抗体的吸收图谱是怎样的？它的特征吸收峰在哪里，不同的多克隆抗体是不是还有自己的特征吸收峰，
抱歉,你是说色谱图还是紫外吸收图呢,蛋白一般都是在280检测的呀,不同的的蛋白虽然有一点差别,但是那也不是很明显的,其实就用280就可以了.
36)我的蛋白以GST融合蛋白的形式表达在EColi中，分子量14~15kDa，蛋白的疏水性很强，等电点在7左右。菌破碎后，用表面活性剂提取的融合蛋白，据文献说是由于此蛋白和细胞膜结合，所以如果不加表面活性剂，上清中电泳检测不到。加表面活性剂后，提取效率还可以。上GST胶。开始时采用先洗脱融合蛋白，再酶切，洗脱采用10mMGSH洗脱，没有加表面活性剂。然后酶切后，就会产生大量沉淀，上清中没有目的蛋白。后来在酶切buffer中也加表面活性剂，就得到了改善，没有再出现沉淀，目的蛋白也存在于上清中。目的蛋白中仅有一个cys。
我的问题是：
1、老板不知从那看了篇文献，是专门讲此蛋白的结构的。不过人家的蛋白是合成出来的，然后用反相C18（300A孔径）分离的。他非要我不上GST胶（因为binding效率不是很高，GST价格很贵，工业化好像也没几家），提取液先酶切，沉淀后离心上反相分离。我觉得沉淀中的杂质组成不很清楚，如果有大一点的蛋白变性沉淀之类，用反相会不会很容易堵柱子？我看一些资料，反相只用来分离或分析短肽，较少用于分离较大的蛋白，尤其是我的杂质都不清楚的情况下。
2、过去曾做过superdex20010/300分离酶切产物时，由于目的蛋白聚集，我也没有marker，每个峰较难定性，电泳看不出来，可能是浓度太低。我想用反相有没有可能建立一种便捷的分析方法来分析纯化过程中目的蛋白的量？
3、我的蛋白酶什么好的测活方法，只能做细胞毒性试验。有一篇文献说在生理条件下，我的蛋白没有二级结构，尽管在一定浓度下未沉淀，但是都以多聚体存在，如果加入50%TFE(三氟乙醇，trifluorethanol),则可使其在中性pH下恢复二级结构，此时大部分以二聚体存在。那么，你用过TFE防止聚集么？这样做有什么根据么？好象一般都只用表面活性剂（对细胞有毒性），或L-arg，PEG之类的，可我没找到在L-arg和PEG存在下，目的蛋白的结构功能方面的文献。现在不清楚多聚体是否就一定没有活性？郁闷阿，望多多指教！
4、我的GST结合效率不很高，总有部分流穿（应该没有超过载量），而放慢流速改观也不明显，后来结合的时候bindingbuffer中也加表面活性剂稍微好一点，但还是不满意。我曾试过把流穿收集再进GST柱，可是几乎不结合，所以我怀疑GST部分可能有变性和不变性两部分。我曾看过一文章，提取时采用离子型表面活性剂，binding时在加入tritonX-100，采用混合表面活性剂，据说可以使GST部分复性，增加binding，我还没有试过。
您有这方面的经验么？多谢了
1,其实反相价格会更好点,因为有机器,柱子和流动相也不便宜,其实我们用的是国产的GST融合蛋白的纯化系统,价格就不贵,你PM你的邮件给我,我给你一份材料,反相柱子其实做不了多少东西,所以建议你别用它制备.
2.只要你有标准蛋白,那用HPLC做分析代替电泳是很不错的,因为这样时间缩短了,效率更高,而且定量很准确.
3.三氟乙醇我的看法是降低了极性,这样你的蛋白不会因为(环境极性大)疏水相互作用太强和聚集,至于活性那你多查文献看有没有别的测法了.
4.至于你柱子挂得少,那有可能是因为有些目标蛋白的结构和能挂上的不一样,那你可以试试降低上样的浓度,包括降低疏水性,加表面活性剂看看,这个不做怕是不知道的,因为只要GST没有活性或被屏蔽,那肯定挂不上.
37)色谱兄能否推荐几种不错的离子交换介质呢？我现在知道有羧甲基纤维素，sp-sepharose等，但是砝码西亚的sp-sepharose太贵了，450/25ml。你能推荐一下比较不错的介质吗？物美价廉的，谢谢！
维素不好操作,还是用琼脂糖的吧.我用的是国产的.你可PM你的邮件给我.我给你相关的材料.
38)一是电泳后凝胶里面德蛋白质有什么可靠的方法回收？
二是我现在有个GST融合蛋白，用thrombin酶切后的目的蛋白条带很弱，请问可能是什么原因有什么办法解决
还真没有做过,你可以用电洗脱的方法,然后浓缩可以用离子交换不就行了或者透析袋加PEG8000浓缩,只怕这样会变性了.
你酶切带弱,那可以尝试增加酶的量,或延长酶切时间,.此外看有pH有没有问题,你的蛋白浓度是不是太低.
39)我所说的大颗粒是指蛋白或病毒颗粒。这些颗粒的直径会大于填料的孔径。谢谢！
完全没有问题,我用琼脂糖凝胶6B给病毒除过盐,也纯化过,这样可以把很多小分子的蛋白去除,再过离子交换就可以比较纯了病毒.病毒都可以,那大分子的蛋白也没有问题,包括质粒也可以用凝胶过滤纯化.
40)谢谢chromatography的答复。介质有现成的，但很贵啊。我要分离谷胱甘肽还原酶，文献都是用2',5'-ADP－Sepharose4B纯化，以后你多留意点，
别客气,我的意思是你用兰色琼脂糖凝胶试试,此外有谷胱甘肽琼脂糖,应该也可以用来纯化谷胱甘肽还原酶吧,或者专门合成一个类似底物的也可以,其实你完全可以自己合成填料的.也许这样能很好地解决你纯化的问题.
