爱华网中药高效液相色谱指纹图谱专利的技术特征分析
中药（或中成药）提取物在一定的色谱条件下，经色谱分析后能得到一张色谱图，虽然目前尚不能说明图上每个色谱峰的归属，但至少可以证明其对应成分的存在，于是由这些色谱峰就构成了被检中药的内在质量。由于每一种中药的内在成分谱是相对固定的，而不同中药的成分谱又是绝对不同的，反映于色谱图上就具有了像人的指纹一样的识别功能。因而，这种色谱图就被称为指纹图谱。
由于高效液相色谱法（HPLC）具有分离效能高、选择性高、检测灵敏高、分析速度快、应用范围广等特点，且方法较为成熟，所以中药样品中含有的绝大多数成分可在高效液相色谱仪上进行分析检测。高效液相色谱法已成为中药指纹图谱研究的首选方法。
高效液相色谱指纹图谱的建立和使用过程包括色谱图的建立、指纹图谱的形成和指纹图谱的评价三个板块，每一个板块都包含了大量的技术信息，体现了发明人的辛勤劳动，如何从中拮取有效信息并形成较为完善、有效的专利申请文案，是对申请人及专利代理人的新考验。笔者根据曾经从事过的高效液相色谱分析工作经验，就中药高效液相法色谱指纹图谱专利中的技术特征提出一点拙见，以期抛砖引玉、共同提高。
一、色谱图的建立
1、对照品
由于色谱法本身的技术缺陷，色谱峰的定位会受到多种因素的影响，因而相同成分的色谱峰在不同的检测过程中都会出现漂移现象，影响了数据的稳定性。同时，每批中药产品的个体差异性，反映在色谱图上也会造成色谱峰数量、保留值、峰面积等的变化。由于中药成分复杂，不能从色谱图上一一获知每个峰所代表的成分，因而上述差异的存在就使得每张色谱图之间失去了可对比性，色谱图也就失去了指纹的意义。为解决这个问题，发明人必须要从该中药成分中选择一种可知的、分离度好的、一般应位于图谱中央位置的成分峰做为对照，然后将其他成分峰的保留值和峰面积与对照峰相比，得到相对稳定的“相对保留值”和“积分面积相对比值”，从而消除了上述缺陷，避免了主观误差。因而，对照品的选择和使用是建立色谱图的必要技术特征，也是发明人的创造性劳动成果所在。
2、色谱条件
（1）洗脱剂及洗脱方法：由于中药成分复杂，各成分的极性差异很大，如使用固定洗脱剂，不能照顾两端成分的充分分离，常造成漏检。因而在做中药色谱分析时，梯度洗脱（分级洗脱）是常用的技术手段。梯度洗脱是在洗脱过程中连续或间断改变流动相中两种或两种以上不同极性溶剂的组成比例，以调节整个流动相的极性，使样品中的所有组分可在最短的分析时间内，以适用的分离度获得圆满的选择性分离。但流动相中洗脱剂的配比及洗脱时间的分配是很困难的，需要发明人有丰富的经验并经过反复的试验才能获得，因而梯度洗脱技术体现了发明人的创造性劳动成果，应做为指纹图谱的必要技术手段。
（2）色谱柱：不同类型的色谱柱具有不同的分离特长和柱效，不同的分离效果将直接影响图谱峰的分离度，因而色谱柱的选择也是必要技术特征。
尽管在高效液相色谱分析中常用的色谱柱种类及使用特性并不复杂，多为C-18反相柱，应是本领域技术人员能够掌握的；即使有变化，也可通过有限次的实验是可以做出选择的。但是随着键合技术的发展，很多色谱柱生产厂家都在发展自己独特的键合技术，对某一类或者几类化合物有着独特的选择性，容易获得更好的分离效果；同时这些厂家为了保护自己，不愿意公开相关的技术，这大大增加了色谱柱筛选的工作量。通常可以认为，如果申请人不特别指出，则使用C-18反相柱是本领域的常规技术手段；如果使用其他类型的色谱柱并以此作为创造性的依据，则申请人应在说明书中阐述使用该色谱柱的非显而易见性。
（3）柱温：本领域技术人员都知道，不同柱温下的同一成分保留时间往往发生迁移，有时还会影响成分之间的分离效果，因而在做高效液相分析时往往要求恒定的柱温。可见，柱温理应成为建立色谱图的必要技术特征。但同时笔者也注意到两点：①有相当一部分高效液相色谱研究并不需要非常恒定的柱温，在正常室温波动情况下依然可以获得较好的色谱图；②即便使用了色谱柱恒温箱，其设定温度也多在30~50℃之间，有时甚至是在室温变化范围内。由此可知，大部分的高效液相色谱图在忽略柱温的情况下仍有可能顺利实现，恒定的柱温只是取得最佳效果的保障因素，因而除非柱温的选择超出常规，否则可将柱温因素排除在必要技术特征之外。
（4）检测条件：包括检测器和检测波长，由于两者是不可分的因素，所以在此也合并评价。使用高效液相做色谱分析时，可用到的检测器包括紫外检测器（Ultravioletdetector ，UV），二极管阵列检测器（Diode arraydetctor，DAD，紫外检测器的一种），荧光检测器（Fluorophotometricdeteetor，FD），电化学检测器（Electrochemicaldetect，ECD），蒸发光散射检测器（Evaporative light scatteringdetector，EISD），示差折光检测器（Diffetential refractive indexdetector，RID）等几种，最常用的是紫外检测器。每种检测器都有自己的特性，必然会影响到色谱峰的检出数量和响应值，所以检测器的选择应做为必要技术特征。
在使用紫外检测器时，因为每种成分只在特定波长下才会有最大吸收，要照顾到中药中所含的各种复杂成分，对紫外波长的选择就很重要。选择紫外波长时应尽量做到：检出已知的对照物或有效成分、检出尽可能多的成分峰、峰的面积尽量大、各峰的分离度尽量好。通常情况下，将样品经紫外全波长扫描，即可获知全成分的最大吸收波长；但要实现制备指纹图谱的要求，则需要经DAD检测后生成三维光谱—色谱图，再由发明人平衡各项指标的取舍后确定最适合的波长。因此，如果是通过紫外检测生成的指纹图谱，检测波长的选择是必要技术特征且应体现了发明人的创造性劳动成果。
最后需要特别指出，一个好的中药高效液相色谱图的建立是综合考虑了包括上述因素在内的诸多因素后的结果，是需要发明人付出大量而复杂的智力劳动的，因而如果权利要求是一个全新的技术方案，则其整体上应具有创造性，只有面对一个改进性发明时，对其中个别要素进行新颖性和创造性的评价才是有意义的。
二、指纹图谱的形成
稳定的色谱图形成后，尚不具备“指纹鉴别”的价值。只有当发明人从该图谱中选择出共有峰计算重叠率、选择n强峰计算峰面积，进而确定特征峰（特征指纹）后，真正的指纹图谱才算建立起来了。事实上，指纹图谱的应用与其附带的上述图谱参数是密不可分的。但对于这些参数的技术特征属性，笔者认为应视情况而定。
1、当发明目的是建立指纹图谱时，如前面所述，图谱参数是图谱特征中不可分割的一部分，应当做为实现发明目的的必要技术特征写入权利要求。但同时还应注意到，图谱参数的确定过程属于专利法意义上的“智力活动的规则方法”，即这些参数是可以人为确定和改变，且不会影响发明目的的实现。所以，将具体的图谱参数写入权利要求又必然会缩小专利的保护范围。
为解决此进退两难的境地，笔者认为可在指纹图谱的权利要求中仅写明类似“从色谱图中选择特征峰建立指纹图谱”的语言即可。一方面，该语言可将指纹图谱的建立过程补充完整，符合必要技术特征的要求，同时又不会对保护范围构成限定；另一方面，图谱参数的确定方法是本领域的“公知常识”，在文献和技术手册上均有介绍，本领域技术人员完全可以在本专利技术方案的基础上自行确定适用的图谱参数。
2、当发明目的是为指纹图谱建立色谱图时，既然技术方案并不是直接得到指纹图谱，也就与图谱参数的确定没有了关系。此时图谱参数及其确定过程均不属于专利的必要技术特征。根据前项所述情况，既然图谱参数及其确定过程并未对指纹图谱专利的形成做出实质性贡献，笔者认为除非图谱参数具有重要的意义，否则以建立指纹图谱为目的的专利不如以建立专用色谱图为发明目的专利更加实用。
三、指纹图谱的评价
指纹图谱建立后，将被检产品的指纹图谱与对照指纹图谱进行比较，从而判别被检产品的真伪及是否合格，是实施中药指纹图谱的最终目的，属于指纹图谱的用途范畴。在将两份图谱进行比较时，一般选取“积分面积相对比值”和“相对保留时间”这两个核心参数，按照一定计算方法得出两份图谱的相似程度，以“相似度（%）”来表达，该数值即为指纹图谱的评价指标。根据国家药典委员会《中药注射剂指纹图谱实验研究技术指南（试行）》要求，一般成品指纹图谱相似度计算结果在0.9～1.0（或以90～100表示）之间作为符合要求[3]。关于相似度的计算方法，目前有三种：手工计算、自编软件计算和官方指定软件计算。其中，手工计算较为复杂，且波动较大；自编软件计算需公开计算方法；官方指定软件是指国家药典委员会的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》，已被行业内认可和使用。关于指纹图谱的评价技术是否应写入权利要求书，笔者认为也应从两个方面来评价。
1、当发明目的是建立色谱图或指纹图谱时，由于技术方案仅涉及图谱的建立方法，与如何使用无关，因而指纹图谱的评价方法无需写入权利要求书。
2、当发明主题类似于“一种运用中药指纹图谱的药物鉴别方法”或“中药指纹图谱在某中药鉴定中的用途”时，图谱评价方法则应当成为必要技术特征。但笔者仍然不赞成将相似度的计算方法列入权利要求，因为将本领域的“公知常识”写入权利要求并不会增强技术方案的创造性，却只会增加申请人和审查员的劳动强度，这是毫无益处的。笔者比较赞成现有某些权利要求书中的写法，如“将供试品指纹图谱与对照指纹图谱进行相似性评价，计算相似度”或“将供试品指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》进行评价，相似度不低于…”，如此既完善了技术方案，又不会造成“多余指定”的情况。
综上可见，中药指纹图谱专利大致分为两类，其一是指纹图谱的建立方法，其二是指纹图谱的鉴定用途，但无论何种主题，其中色谱图的建立方法才是真正的区别技术特征，指纹图谱的参数选择和评价方法虽可以做为必要技术特征，却并不会给技术方案的创造性带来任何贡献。所以申请人应选择适当的技术方案做为独立权利要求，并在申请文件中重点阐述该技术方案的产生及其有益效果，如此既能满足专利法及其实施细则对专利申请文件形式上的要求，又能从实质上对自己的劳动成果形成最有效的保护。
