肿瘤转移的研究现状与治疗前景展望5 公司前景展望

二、肿瘤转移抑制蛋白——抗癌治疗新希望

肿瘤转移抑制蛋白（Metastasis suppressorprotein）能够在肿瘤转移的多个步骤中发挥调控作用。这些步骤包括肿瘤细胞侵入血液循环系统及淋巴系统并在其中存活、随其转运以及到达远隔器官并在其中克隆性增殖等。因此弄清楚肿瘤转移抑制蛋白的生物学功能可以为我们开发出更有效的疗法来为肿瘤治疗提供更多、更好的思路。有好些研究者已经报道使用转基因等技术介导基因表达恢复了肿瘤转移抑制蛋白的功能，并由此弄清楚了肿瘤转移抑制蛋白的下游信号通路情况。虽然目前这些研究方法还没有在临床上得到广泛应用，但是其中有一些已经进入了临床前检测阶段甚至进入了临床试验阶段。

人体内有无数的致癌基因与抑癌基因在发挥作用，它们参与了肿瘤转化和发生的过程。这些基因分别对随后的原发灶肿瘤的发展过程起到了正向和负向的调控作用。现在，我们又发现了一大类新基因。这些新基因能够在肿瘤转移（血道或淋巴道转移途径）的过程当中起到促进或抑制的作用。这些在转移过程中发挥作用的基因与上述在肿瘤发生发展过程中发挥作用的基因一样，既有促转移基因，也有抑制转移基因，正如既有Ras基因和SRC基因，也有PTEN基因和p53基因一样。

在上述参与调控肿瘤转移过程的基因中，如果有一些基因不表达或者无功能，那么肿瘤就会发生转移，这些能够抑制肿瘤侵入、散播、停滞与存活，并开始新一轮克隆性生长的基因就是肿瘤转移抑制基因，但是肿瘤抑制基因并不会抑制转化细胞在原发灶形成肿瘤的过程（这是抑癌基因的工作）。本文将向大家介绍肿瘤转移抑制基因以及它们在肿瘤治疗工作中的意义和作用，并对这方面的临床操作实际可行性问题展开讨论，同时还将介绍几例已经初步展现出治疗前景的实例。

1.肿瘤转移抑制基因简介

直到最近几年，被我们发现的肿瘤转移抑制基因才逐渐多了起来。就在5年以前，我们只知道8个肿瘤转移抑制基因。广义上说，这些基因都具有一个共同的功能，即调控关键的信号通路，比如G蛋白藕联受体信号通路（G-protein-coupledreceptor signalling）、酪氨酸激酶受体信号通路（tyrosine kinase receptorsignalling）、小GTP酶信号通路（smallGTPase）和MAPK信号通路等等。后来几年又陆续发现了更多受到肿瘤抑制基因调控的信号通路。最近有一篇综述提到，研究人员已经发现了23种肿瘤抑制基因，其中包括能调控上述这些信号通路的基因以及能够调控肿瘤细胞粘附、迁移、死亡以及血管生成过程的基因。2008年，人们又发现了一种全新的、能够抑制肿瘤转移的miRNA。这些miRNA能够与相应被调控靶基因mRNA3’ UTR结合来发挥调控肿瘤转移的作用。

我们到目前为止只发现了为数很少的几种肿瘤抑制基因是因为不仅需要相关数据信息来发现并确定这些基因，同时还需要用能够真实模拟体内肿瘤自然转移过程的模型来验证这些基因抑制肿瘤转移的功能。幸好有了免疫缺陷肿瘤异种移植物小鼠动物模型，我们才得以开展肿瘤抑制基因的相关研究工作。有关肿瘤抑制基因的相关研究工作一般包括：通过对各种转移细胞或组织进行比对，从中筛选候选基因的工作、检验这些候选基因的表达情况或突变情况，还有最为重要的、必不可少的一项工作就是进行体内转移试验，来验证这些候选基因是否真的是肿瘤抑制基因，即是否具有抑制肿瘤转移的作用，同时又不会影响肿瘤发生过程以及影响肿瘤细胞的增殖（背景知识1）。

背景知识1：肿瘤转移抑制基因的发现及验证历程
对具有不同转移能力的肿瘤细胞进行筛选，发现其中表达有差异的基因，通过这种方法来发现肿瘤转移抑制基因
我们使用了很多策略来发现肿瘤转移抑制基因，比如染色体转移技术、差异显示技术、扣除杂交技术（subtractivehybridizationtechnique）、芯片比较技术等。通过这些技术对具有不同转移能力的肿瘤细胞进行筛选。最近，因为肿瘤组织学家们的努力，我们又获得了更多肿瘤细胞的芯片表达数据。这些数据会更好地帮助我们发现肿瘤转移抑制基因，因为我们可以利用不同阶段的肿瘤数据来对这些候选基因进行验证。
在患者体内如果缺乏上述候选基因就会发生肿瘤转移的现象
对候选基因进行验证包括在人体肿瘤组织，最好是转移瘤组织里验证其表达和功能。不过要获得转移组织一般来说都比较困难。相比之下检测肿瘤的转移能力似乎更加具有可操作性。比如可以验证肿瘤原发细胞中如果缺失了上述候选基因是否会导致肿瘤转移等。
在体内试验中验证其肿瘤转移抑制功能
我们一般都是使用外源表达有上述筛选出来的候选基因的细胞和对照细胞来证实肿瘤转移抑制基因的功能的，这是证明其肿瘤转移抑制基因身份的必要条件。这些试验常用的方法是将肿瘤来源细胞注入啮齿动物体内，使用自发转移试验检测正位异种移植模型和皮下或异位异种移植模型。这种方法可以检测出肿瘤转移过程中的大部分步骤，但并非所有类型的肿瘤都有异种移植模型可供试验检测。还有一种试验方法是将肿瘤细胞直接注入动物动脉或静脉内，虽然这样只能检测肿瘤转移过程里肿瘤细胞进入循环系统之后发生的情况，但是这种方法与自发转移试验相比速度要快得多，重复性也高得多。

肿瘤转移相关背景知识速览
●肿瘤转移现象是肿瘤（癌症）高发病率和高致死率的原因。有越来越多证据显示，肿瘤细胞在癌症发展的早期其实就已经开始从原发灶脱离并转移到别处了，这和我们以前的观点是不同的。
●肿瘤转移过程既可以受到一些蛋白的促进，即正向调控作用，也可以受到一些蛋白的抑制，即负向调控作用。
●肿瘤转移抑制基因编码的蛋白能够在体内阻止或抑制肿瘤转移过程，但不会影响到原发灶肿瘤的生长。这一点与抑癌基因编码蛋白是不同的，抑癌蛋白能够抑制原发肿瘤发生。
●肿瘤转移抑制蛋白通常都会在肿瘤进展过程中缺如，但是不会在肿瘤细胞转化过程中缺如。
●直到最近，我们才发现了少数几种肿瘤转移抑制基因。不过我们相信，伴随着基因组学技术的进展，我们会发现更多的肿瘤转移抑制基因，知道这些基因参与了哪些细胞生理过程。
●我们已经知道肿瘤转移抑制基因参与了肿瘤转移过程中的多个步骤，还发现有几个肿瘤转移抑制基因能够特异性地抑制转移肿瘤的定居繁殖过程，即少数转移细胞在远隔器官处从微小转移灶逐渐生长形成临床可见的、致命的巨大转移灶过程。
●最近的研究发现，我们可以通过一些方法重获肿瘤转移抑制基因的功能。这些方法包括外源表达或内源表达这些肿瘤转移抑制基因、直接施用这些肿瘤转移抑制蛋白，或者施用针对肿瘤转移抑制基因重要下游靶点的药物等。

2.从功能基础研究到临床实际应用

开发针对肿瘤抑制基因疗法的基本原理与开发针对肿瘤转移疗法的基本原理是一样的。不过我们从对肿瘤抑制基因的研究当中发现了转移肿瘤的“致命伤”，即在转移灶处发生的克隆性增殖过程。我们利用转移肿瘤的这一“死穴”或许就能够解决这一顽疾。有意思的是，循环肿瘤细胞（circulatingcancercell）或者是那些在转移灶部位发现的肿瘤细胞虽然非常常见，而且在患者体内或者在动物模型体内都会在早期被发现，但它们居然都不是我们可攻击的靶标。不过这些肿瘤细胞到达转移灶之后开始异位克隆性增殖这一过程却是一个效率非常低的过程。甚至在美国的一份流行病学调查报告里也提及了在大部分较常见的肿瘤里都会出现的这种早期转移现象。Steeg等人仔细搜索了美国国立癌症研究院（USNational CancerInstitute）的SEER数据库，分析了几种常见肿瘤确诊时的肿瘤分期情况，结果发现在临床确诊肿瘤时尚未出现明显转移灶的患者人群中，仍然有29%~37%的患者的局部淋巴结呈肿瘤细胞阳性。

简而言之，很多肿瘤在得到临床确诊之前就已经发生广泛转移了。因此，正如一些学者认为的，有些患者虽然原发肿瘤得到了很好的治疗，但如何应对后期肿瘤复发仍然是一个棘手的问题。这实际上也属于辅助治疗范畴，即在针对原发肿瘤进行治疗的同时或之后，继续针对转移灶进行治疗。对于基于肿瘤转移抑制基因的疗法来说，我们使用的就不再是传统的细胞毒性抗肿瘤药物了。目前这种基于肿瘤转移抑制基因的疗法的主要目的在于延缓肿瘤的复发，这实际上也就等于“治愈”了患者，因为肿瘤如果不复发，这些患者也就不会因为肿瘤而致命。

虽然不是所有的肿瘤转移抑制基因都能抑制肿瘤克隆性增殖过程中的限速步骤，但是有好多研究证明，的确有一些肿瘤转移抑制基因是能够抑制肿瘤克隆性增殖过程中的限速步骤的。在试验中发现，某些肿瘤转移抑制基因的表达能显著地抑制转移灶处于休眠状态的单个或小簇肿瘤细胞的增殖活力，而对照组的肿瘤细胞则能够明显增殖，形成转移瘤（macrometastaticnodule）。

到目前为止，已经明确具有抑制肿瘤转移功能的基因包括KISS1基因、KAI1基因（又名CD82基因）、NM23基因（又名NM23-H1基因或NME1基因）以及MAP2K4基因等。需要说明的是，还有一些肿瘤转移抑制基因是针对肿瘤转移过程中的其它步骤来发挥作用的。实际上，通过试验发现，很多肿瘤转移抑制基因都是针对肿瘤活动力、侵入性以及散播过程中的存活率来发挥作用的（图1）。但是对于早期就发生广泛转移的肿瘤细胞来说，相比针对克隆性增殖步骤这一靶点，上述靶点似乎不太适合用于发展治疗方法。

肿瘤转移抑制基因能够在肿瘤转移灶的形成过程中发挥作用这一现象说明，如果能够恢复这些基因的功能可能会是一条治疗肿瘤转移的好方法。最近已经有报道称有研究人员分别用几种方法重建了上述几个被证实有效的肿瘤转移抑制基因的功能，结果证实这种方法在临床前研究中是有效的（表1）。这些方法大致可以分为三大类，包括诱导内源基因表达或通过基因疗法来表达肿瘤转移抑制基因、直接施用肿瘤转移抑制基因编码蛋白以及直接针对肿瘤转移抑制基因的下游信号通路（图2及图3）。下面我们将针对上述三种方法逐个进行讨论，还将探讨一下如何利用先进的药物基因组学方法和生物信息学方法来帮助我们针对肿瘤转移过程中的靶点找到突破口。

BMP4, bone morphogenetic protein 4：骨形态发生蛋白4；BRMS1, breast cancermetastasis suppressor 1：乳腺癌转移抑制蛋白1；DARC, Duffy chemokinereceptor：达菲趋化因子受体；EGFR, epidermal growth factorreceptor：表皮生长因子受体；HDAC, histone deacetylase：组蛋白脱乙酰基酶；MKK4, MAPKkinase 4：促分裂原活化蛋白激酶4；RHOGDI2, RhoGTPase dissociation inhibitor2：Rho GTP酶解离抑制蛋白2；RKIP, Raf kinase inhibitoryprotein：Raf激酶抑制蛋白。

3.以基因表达作为治疗策略

3.1NM23基因
NM23基因，又名NME1（非转移细胞1，non-metastatic cells1）基因。它是第一个被发现，同时也是被研究得最充分的一个肿瘤转移抑制基因。早在1988年，Steeg等人就通过差异杂交方法比较了两种分别具有高转移特性和低转移特性的K-1735鼠黑色素瘤细胞系细胞的基因表达谱，发现了NM23基因。后来又用体内和体外实验发现，NM23基因的表达产物可以抑制肿瘤转移而不会影响肿瘤细胞的生长。随后，我们又在人体基因组中发现了8个NM23基因的同系物，其中NM23-H1基因（又名NM23基因）和NM23-H2基因（又名NME2基因）也具有抑制肿瘤转移的作用。与此同时，另一些研究人员运用不同的实验方法在不同的细胞系里验证了这些研究结果的真实性。

NM23蛋白具有几项非常有意思的功能。首先，它具有组氨酸激酶活性，能够抑制Ras蛋白活性，导致KSR1蛋白降解，抑制MAPK信号通路，而我们知道MAPK信号通路在很多肿瘤细胞里都会表现出增强肿瘤细胞活力、移动能力以及其它一些与转移相关能力的作用。在体内试验中发现，某些内源性或外源性的病毒蛋白可以通过与NM23蛋白相结合来调节其活性，这些病毒蛋白包括EB病毒核抗原1和EB病毒核抗原3c。该研究结果表明NM23蛋白的确具有抑制肿瘤转移的作用，而且，NM23蛋白还可以通过抑制促肿瘤转移基因的表达来发挥抑制肿瘤转移的作用。

我们现在对NM23蛋白的治疗应用研究主要都集中在其启动子方面。该启动子受糖皮质激素反应途径（glucocorticoidresponsepathway）调控。虽然糖皮质激素受体激动剂地塞米松不能促进NM23蛋白的表达，但是孕酮（progesterone）和不典型糖皮质激素受体激动剂醋酸甲羟孕酮（medroxyprogesteroneacetate, MPA）却都能以一种依赖糖皮质激素受体反应元件（glucocorticoid receptor responseelement-dependent）的方式诱导NM23蛋白的表达。MPA通常都是以低剂量的方式来使用的，但是在乳腺癌的临床试验中却给予了高剂量的MPA进行治疗。对MPA作为肿瘤转移抑制剂的临床前药物评估结果表明，它具有极大的应用前景。在给裸鼠移植了MDA-MB-231细胞系细胞（人乳腺癌细胞）四周之后，在肺部会出现微小转移灶。然后将这些裸鼠随机分成两组，即对照组与MPA治疗组。在MPA治疗组里，裸鼠的血药浓度大致与人体内的血药浓度相当。结果在两次单独实验里都发现，MPA治疗组发生肿瘤转移的裸鼠比例都有明显下降，降幅分别达到了27%和36%，同时也发现在MPA治疗组，平均荷瘤率也有明显下降。用免疫组化法（immunohistochemistry）检查NM23蛋白表达水平时发现，在MPA治疗无效动物里的信号强度要比未受MPA治疗组裸鼠高得多。在这些非常喜人的实验结果基础之上，我们开始了MPA的II期临床试验，以检验MPA在伴有或不伴有施用低剂量抗血管生成药物环磷酰胺-氨甲喋呤（cyclophosphamide–methotrexate）这种节奏性化疗（metronomicchemotherapy，即连续低剂量口服化疗方案）方法时，对难治性激素受体阴性（hormonereceptor–negative）乳腺癌转移患者的治疗效果。有报道称维甲酸（retinoicacid）和雌二醇（oestradiol）也能诱导NM23蛋白表达。

也有学者尝试在卵巢癌转移瘤小鼠动物模型（该模型由SW626细胞系变种细胞构建而成）上实验使用腺病毒载体基因疗法来恢复NM23蛋白的功能。将这些肿瘤细胞注入小鼠体内形成异种移植瘤之后，再腹腔注射能表达NM23蛋白的腺病毒载体。使用该方法能显著降低小鼠肝转移的概率，抑制率达到60%（p=0.01）。同时，小鼠的平均生存时间相较对照组也明显增加，平均存活天数要多出35天（p< 0.05）。

3.2KAI1基因
诱导表达另一种内源性肿瘤转移抑制基因KAI1基因的方法也有报道。KAI1蛋白的肿瘤转移抑制活性最初是通过将人体第11号染色体转移至AT6.1大鼠前列腺癌细胞当中而被发现的。随后我们克隆得到了抑制基因位点，并在体内试验中验证了它的肿瘤转移抑制活性。KAI1蛋白是一种膜结合蛋白，我们已经发现了有关该蛋白的两个重要的抑制功能，分别是下调表皮生长因子受体信号通路（该通路与受体灵敏度降低及被细胞内吞作用增强有关）的作用，以及一条新的，包括KAI1蛋白和达菲抗原趋化因子受体（Duffyantigen receptor forchemokines，DARC该蛋白在内皮细胞中表达）的信号通路。处于循环系统内的表达有KAI1蛋白的细胞能通过KAI1蛋白与DARC蛋白间的相互作用与内皮细胞相结合，这种相互作用与诱导KAI1蛋白阳性的肿瘤细胞停止增殖并老化有关，不过不表达KAI1蛋白的肿瘤细胞不会受到这种机制的影响。

与NM23蛋白一样，我们也可以用好几种方法来获得KAI1蛋白的活性。早期实验研究发现，p53蛋白能通过p53反应元件（p53-responsiveelement）来促进KAI1基因的转录。随后对前列腺癌组织样品用免疫组化的方法进行研究验证了上述观点。实验发现，p53蛋白与KAI1蛋白在细胞内的表达量具有明显的相关性。在此基础之上，Mashimo等人又使用依托泊苷（etoposide）这种p53诱导剂进行了实验，结果发现依托泊苷也能够增加KAI1蛋白的表达量，这进一步证明了上述观点，同时也表明，这有可能是一条抗癌治疗的新靶点。Wu等人在给小鼠脾脏注射了胃癌肿瘤细胞之后施用了依托泊苷给予治疗，结果观察到在脾脏转移瘤细胞里KAI1蛋白表达量增加，同时降低了肝脏转移灶出现的几率，不过实验并不能证明这种肿瘤转移抑制作用是特异性地由KAI1蛋白的作用而导致的。无论如何，这个实验结果对于我们来说都是一个非常好的消息。因为依托泊苷是一种口服药物，所以它非常适合长期用药，也可以通过前文中所述的节奏式化疗法来服用。但是由于依托泊苷和p53蛋白具有多效性，因此它们对KAI1蛋白的诱导作用可能会比较弱，这就需要我们进行进一步的研究，弄清楚其中的细节问题。

还有一种方法能够让前列腺癌细胞长期内源性表达KAI1蛋白，有望达到治疗的目的。该方法使用大豆来源的植物雌激素——大豆异黄酮（isoflavone）5,7,4′-三羟基异黄酮。ElTouny等人最近报道，使用5,7,4′-三羟基异黄酮之后，能在TRAMP前列腺癌小鼠模型体内试验中观察到KAI1蛋白表达增多的情况。在体外实验中也观察到，5,7,4′-三羟基异黄酮能够抑制TRAMP前列腺癌小鼠肿瘤细胞的侵袭行为，而5,7,4′-三羟基异黄酮的这种作用经过特异性针对KAI1蛋白的siRNA试验证明，这种作用正是通过特异性的诱导KAI1蛋白的表达而不是其它可能被5,7,4′-三羟基异黄酮诱导表达的蛋白而获得的。不过我们还没有在临床前试验中对5,7,4′-三羟基异黄酮抑制TRAMP肿瘤转移的作用进行检验，也不清楚KAI1蛋白诱导表达的具体机制。

当然，也有人运用传统的基因疗法来提高KAI1蛋白的表达量。Xu等人直接给裸鼠皮下移植的MiaPaCaII胰腺癌细胞中注射了能表达KAI1蛋白的质粒，分别通过盐水和脂质体包裹质粒进行注射。结果发现注射质粒之后能明显抑制肿瘤肺转移。还有人使用正位非小细胞肺癌淋巴转移小鼠模型（orthotopicnon-small-cell lung cancer lymphatic metastasis mousemodel）和复制缺陷型的腺病毒载体进行了研究。他们通过给同系基因型小鼠肺部注射lewis肺癌细胞构建了动物模型，然后三次气管内施用能表达KAI1蛋白或对照蛋白lacZ的腺病毒，三周以后称量肺脏和转移淋巴结的重量。结果发现用表达KAI1蛋白腺病毒组的小鼠纵膈淋巴结（转移灶）重量明显要比对照组轻，但是肺脏（原发灶）重量则没有明显区别。

3.3RKIP基因
Raf激酶抑制蛋白（RKIP，也被称为PEBP1）是最近被发现的一种肿瘤转移抑制蛋白，它可以抑制常位移植到小鼠体内的C4-2B人前列腺癌细胞的转移。最初我们通过酵母双杂交技术筛选到得RKIP蛋白。我们发现它可以和RAF1激酶结构域相结合，竞争性抑制RAF1与MEK之间的相互作用，从而下调这条信号通路。在前列腺癌以及其它一些肿瘤细胞里，RKIP蛋白的表达是缺失的。最近有报道称，可以通过一些方法诱导内源性RKIP蛋白的表达。

内源性RKIP蛋白能够被一种组蛋白脱乙酰基酶（histonedeacetylase）抑制剂——曲古抑菌素A（trichostatinA）所诱导表达，说明曲古抑菌素A有望成为一种新型的抗癌药。实际上，目前正有人在对该药物进行抗癌疗效方面的研究。同时，这也告诉我们，可以使用染色质修饰药物来诱导肿瘤转移抑制基因的表达。虽然这种药物的特异性相对比较低，即它可以诱导多种抑制基因表达，但这恰好是它的一大优点，比如它也可以诱导另一种最近刚刚发现的肿瘤转移抑制基因DLC1基因的表达，这样我们就可以使用染色质修饰药物同时诱导多个肿瘤转移抑制基因的表达，使它们共同发挥作用。最近发现，另一种染色质修饰药物，DNA甲基转移酶抑制剂（DNAmethyltransferaseinhibitor）——5-氮杂胞苷（5-azacytidine）也能诱导肿瘤转移抑制基因NDRG1基因和NM23基因的表达。

3.4前景
作为一种普通的治疗策略，诱导内源基因表达（图2a、b）是非常自然，同时也非常吸引人的一种方法，尤其是在我们可以通过口服生物活性药物来达到这一目的的情况下更是如此。但是到目前为止，这种方法只能对基因表达被抑制的情况起作用，如果基因因为突变或其它原因发生丢失，则无法诱导其表达。虽然有人认为，在大部分肿瘤细胞里，肿瘤转移抑制基因都只是被抑制而已，但还是有人观察到这些基因发生突变的情况。实际上，用各种方法诱导肿瘤转移抑制基因内源性表达这一方法凸显了该方法的一大优势，这是利用抑癌基因的方法所无法比拟的优势。因为抑癌基因通常都是因为突变而失活的，所以无法诱导表达内源性的抑癌蛋白。不过这些基因表达缺失的原因是因人而异、因基因而异的，只有准确弄清每个病人体内每个基因表达缺失的情况，才能对症下药。由于不是所有的肿瘤转移抑制基因都能够被非常好地（耐受）人为诱导表达，比如使用MPA这样，所以还需要努力寻找口服的能够诱导肿瘤转移抑制基因表达的药物。因此，尽管我们已经认识到要使用外源性基因表达法来治疗肿瘤还存在很多困难（图2c），但是面对很难诱导其表达的内源基因时，该方法还是很有效的。

4.直接施用肿瘤转移抑制蛋白

4.1KISS1基因
直接施用肿瘤转移抑制蛋白KISS1的方法已经在进行临床前实验了。有人给缺失了KISS1蛋白功能的患者施用KISS1蛋白，来观察它对肿瘤转移抑制的作用。最初我们是在将人黑色素瘤细胞C8161细胞与在其中转入了人6号染色体的C8161细胞进行扣除杂交研究时发现了KISS1基因。在黑色素瘤转移灶细胞中经常会缺失6号染色体，而研究发现，6号染色体具有抑制黑色素肿瘤转移的作用。KISS1基因位于1号染色体上，但是它受到位于6号染色体上的反式激活物因子调控。KISS1基因的编码产物是一种名为kisspeptin（或称为metastin）的分泌蛋白，该蛋白至少能与一种名为KISS1R或GPR54的G蛋白藕联受体相结合。虽然我们还不清楚肿瘤转移抑制作用的下游信号途径，但是有报道称KISS1蛋白表达是抑制肿瘤转移的必要条件，同时发现分泌的KISS1蛋白能使散播的肿瘤细胞处于休眠状态，因此，阻止了转移瘤细胞的克隆性增殖过程发生。

Ohtaki等人在一项临床前研究中发现，通过渗透泵给患者注入KISS1蛋白衍生物肽段，可以明显抑制KISS1R蛋白过表达的B16-Bl6黑色素瘤细胞发生自发肺转移，与对照组相比，有效率高达66%（p<0.01）。因此，Ohtaki等人认为，在后续的临床试验中，这种治疗方法也会使转移瘤细胞处于休眠状态，从而达到抑制肿瘤转移的作用。不过最近有人质疑，KISS1蛋白的肿瘤转移抑制作用究竟是通过肿瘤细胞表达的KISS1R来发挥作用，还是通过旁分泌（paracrineeffect）的方式对周围的间质发挥作用，抑或是通过一些未知的受体来发挥作用的。不过无论如何，使用KISS1蛋白都是一条非常有希望的肿瘤治疗新方法。另一篇最近发表的论文报道了他们对KISS1蛋白小分子类似物进行的研究工作，该项研究工作也为我们打开了另一条使用KISS1蛋白的新途径。虽然已经有人将KISS1蛋白的部分肽段使用到了患者身上，而且短期内观察，患者对这类药物的耐受性都很好，但是有人在动物模型上进行了长期的临床前研究发现，这类药物会对垂体性腺轴（pituitary–gonadalaxis）系统造成影响，即如果长期使用该类药物，可能会对男性患者带来一定的毒性作用。同样，任何其它小分子类似物也都应该接受这样仔细的临床前和临床试验的检验。如果要将该技术成功应用到临床，那么这些问题就一定要弄清楚，因为要阻止形成巨大转移灶，我们需要长期使用这些药物。

4.2 BMP4基因
与分泌型的KISS1蛋白一样，成骨蛋白4（bonemorphogenic protein 4，BMP4）蛋白也是一种分泌蛋白，它属于转化生长因子β超家族（transforminggrowth factor-βsuperfamily）成员，也是最近报道的一种肿瘤转移抑制蛋白。Eckhardt等人最近发现BMP4蛋白表达抑制与小鼠乳腺癌转移增多有关。他们用实验证实，在4T1.2小鼠乳腺癌细胞中过表达BMP4蛋白能够抑制自发性转移，但是不能抑制肿瘤发生；如果用RNA干扰技术抑制BMP4蛋白的表达，则会使原本转移能力不高的细胞转移能力增强。最后，Eckhardt等人还在乳腺癌转移小鼠模型中进行了临床前实验，他们发现腹膜内注入重组BMP4蛋白同样也能起到抑制肿瘤转移的作用，增强小鼠的存活率。

不过似乎不太可能对每一种肿瘤转移抑制基因都使用这种重组蛋白的方法（如图2d所示），因为有很多肿瘤转移抑制蛋白都是跨膜蛋白或是细胞内蛋白。实际上，除了上述两种分泌型肿瘤抑制蛋白之外，到目前为止，我们只发现了另外一种分泌型肿瘤抑制蛋白——结缔组织生长因子（connectivetissue growthfactor，CTGF）。但是无论如何，我们对KISS1蛋白和BMP4蛋白开展的这些研究工作都为将来的临床应用打下了坚实的基础。

5.肿瘤转移抑制基因的下游信号途径

我们已经知道，有好几个肿瘤转移抑制基因都能对肿瘤细胞里的信号通路进行调控，于是有人设想，表达这些信号通路的下游因子是否会增强肿瘤细胞的侵袭能力与转移能力，它们是不是也可以作为治疗靶点呢？最近有两项研究显示，上述这两个问题的答案可能都是肯定的，而且这些研究已经初步获得了有望在临床上发挥作用的药物作用靶点。

5.1 RHOGDI2基因
RhoGTP酶解离抑制蛋白2（RhoGTPase dissociation inhibitor2，RHOGDI2，也被称为ARHGDIB）属于RHOGDI家族，它能下调处于活化状态的Rho家族GTP酶的活性。RHOGDI2蛋白最初是在人膀胱癌细胞中发现的，科研人员比对了T24膀胱癌细胞及其转移灶细胞T24T细胞的转录组，然后使用源自其它多种人体肿瘤细胞的基因芯片数据（这些数据都是源自肿瘤各个阶段基因表达下调的基因）对转录有差异的基因进行筛选，结果发现了RHOGDI2基因。RHOGDI2蛋白能抑制T24T细胞在试验动物体内形成肺转移灶，但不会影响原发肿瘤的生长。而且，我们还观察到RHOGDI2基因表达缺失的膀胱癌患者存活率极低，RHOGDI2基因表达缺失的乳腺癌患者比较容易发生淋巴结转移，而且RHOGDI2基因表达缺失可以作为判断乳腺癌患者是否容易发生转移的基因信号。

假定RHOGDI2基因表达缺失会导致信号通路失调，而转录水平的改变是肿瘤发生转移的必要条件，于是有人在T24T细胞中转入了RHOGDI2蛋白，来观察会得到什么结果（图3a）。那些在转染了RHOGDI2基因的T24T细胞中，转录体被下调，而在人膀胱癌细胞中转录体上调的基因被挑选出来进行下一轮深入研究。经过这种筛选，我们得到了内皮素1（endothelin1，ET1）。内皮素是一种血管收缩因子，它对内皮素A受体的作用可以被阿曲生坦（atrasentanhydrochloride）这种内皮素受体拮抗剂所抑制。需要提醒的是，阿曲生坦由于一些与它和RHOGDI2蛋白之间联系无关的原因，目前还处于对IV期前列腺癌患者进行试验的III期临床试验过程当中。在给静脉内注射了T24T细胞的小鼠动物模型使用阿曲生坦之后会明显降低动物体内发生转移灶的几率，实验组只有5%的小鼠出现转移，而对照组则有53%出现转移（p<0.0001）。由于阿曲生坦是口服药物，对前列腺癌和肺动脉高压也有治疗作用，因此非常适合作为化疗后预防肿瘤转移的辅助治疗药物。有趣的是，RHOGDI2蛋白也能抑制神经介素U（neuromedinU）的表达。神经介素U与ET1有很多相似之处。在动物实验中发现，神经介素U既能促进转移肿瘤的生长，也能促进恶病质（cachexia）的发生。这再一次证实了受到肿瘤转移抑制蛋白调控的下游因子对于肿瘤转移具有十分重要的作用。不幸的是，我们目前还没有发现能阻断神经介素U受体的药物。如果真有这种药物，将会为我们提供一条针对RHOGDI2蛋白下游通路的新途径。

5.2 NM23基因
我们使用了与前面相同的方法在MDA-MB-435乳腺癌细胞（需要提醒大家注意的是，关于MDA-MB-435细胞究竟是起源于乳腺癌细胞还是黑色素瘤细胞目前还存在争议）中发现了受NM23蛋白调控的转录体，即候选基因。然后如图3b中所示的那样，通过比对转染了NM23基因的细胞和对照细胞里候选基因的表达差异对这些基因进行进一步确认。同时也通过源自两组乳腺癌患者的基因芯片分析数据，找出那些表达情况与NM23基因表达负相关的基因，与上述候选基因进行比对，以进一步确认哪些基因是真正受到NM23基因调控的下游基因。结果，我们发现了溶血磷脂酸受体（lysophosphatidicacidreceptor，LPAR1，也被称为EDG2）。在乳腺癌细胞中外源表达LPAR1蛋白可以恢复被NM23蛋白所抑制的细胞活动转移能力。这些实验结果表明，肿瘤细胞内NM23蛋白表达水平降低之后会促使LPAR1蛋白表达水平增高，增强细胞的活动转移能力。

由于细胞的活动能力只是影响肿瘤转移的一个因素，因此有人又进行了体内试验，他们将NM23基因和LPAR1基因共转染一个细胞，来观察这种细胞在体内形成转移灶（肺转移）的能力。结果发现，LPAR1基因表达水平增高不仅能够延长静脉注射入实验动物体内的MDA-MB-435细胞在肺内的停滞时间，还能恢复被共表达NM23蛋白所抑制的肿瘤细胞活力。这项研究成果促使我们想到，可以使用Edg家族蛋白拮抗剂来进行治疗，比如可以使用LPAR1蛋白的拮抗剂Ki16425来防止肿瘤转移。目前有关Ki16425药物的临床前实验正在进行之中。

6.未来的发展方向以及新兴技术

前文中提到的研究肿瘤转移抑制基因下游靶标的方法太过于依赖基因表达芯片数据，虽然我们碰巧发现了ET1基因和LPAR1基因，但我们不会每次都这么好运。我们需要的方法是最起码能在每次试验中都发现一点蛛丝马迹，比如肿瘤细胞因为表达了肿瘤转移抑制基因从而无法转移，同时也发现因为表达了该转移抑制基因，细胞内某些基因的表达发生了改变等等。不过值得期待的是，最近刚刚出现的ConnectivityMap计划可以为我们提供一个很好的机会，帮助我们系统地发现肿瘤转移抑制基因的下游靶标。

ConnectivityMap计划实际上是一个大型的基因表达数据存储数据库。我们用1000种以上的小分子药物处理几种细胞系之后，提取数据存入ConnectivityMap中，通过这些数据我们就可以知道，哪些药物会对细胞的基因表达造成哪种影响。我们可以利用这些数据，将它们与细胞内表达肿瘤转移抑制基因之后发生的后续基因表达改变情况相比较，通过这种比对就可以系统地发现这些能够影响整条信号通路的药物的潜在的作用靶点，从而避免像搜寻ET1基因和LPAR1基因那样，一个一个地去寻找药物靶点。这种方法相比前面提到的那种方法会更有效，因为该方法能回复参与肿瘤转移过程的基因。而且，这种以实际用药效果为基础的方法更有利于我们发现哪些药物针对哪种细胞里的哪条信号通路发挥作用，从而能够找出合适的分子标志物来帮助我们筛选出最适合使用该药物的患者，这也非常符合未来个体化医疗的发展趋势。

信息技术最近的发展也为我们提供了很大的便利，我们能更准确地利用药物在细胞模型上的实验结果来预测药物在人体内的疗效。我们将细胞基因表达谱芯片检测结果和体外药敏实验结果相结合，这样就能非常准确地预测药物对细胞的作用，然后再将这些结果应用到每一个单独的细胞系，或者患者。在所有这类方法中，共表达外推法检测系统（CoexpressionExtrapolation,COXEN）非常适合用于药物筛选，尤其适合用于发现与转移抑制基因失调有关的药物。实际上COXEN系统就是一套算法系统，它可以根据基因表达芯片的数据和以往NCI-60对各种肿瘤细胞系进行药敏实验的经验数据推算出哪些基因的表达差异会与某些药物有关。然后再使用一套特殊的算法对这些在细胞试验中对药物敏感的基因表达情况与人体肿瘤细胞中同一基因的表达情况进行比较，以最终确定可作为治疗靶点的基因。

更为重要的是，COXEN系统也能进行计算机辅助药物研发工作，它可以基于药物的体外实验结果帮助我们发现最有可能在人体内起效的药物。因此，ConnectivityMap计划可以使用表达或不表达肿瘤转移抑制基因的细胞表达谱芯片数据来初步筛选药物，然后再使用COXEN系统和NCI-60系统对初筛结果进行进一步筛选，这样就能发现既能在体外发挥作用，同时也最有可能在体内起效的药物（图4）。

在药物研发工作中的另一项重要进展就是合成致死筛选（synthetic lethalscreens）。该方法现在已经应用到肿瘤转移抑制基因的研究工作当中了。这种方法的原理是，如果细胞缺乏某种蛋白，比如肿瘤转移抑制蛋白，那么它对于某些药物就要比不缺乏这种蛋白的细胞更敏感。Wang等人已经用这种方法对胰腺肿瘤抑制基因SMAD4进行了检测。他们使用药物合成致死法以一大类药物对外源表达和不表达（使用RNA干扰技术）SMAD4蛋白的同系细胞进行了筛选。结果Wang等人得到了特异性对不表达SMAD4蛋白的细胞有毒性的药物。这种方法当然也可以用于筛选针对肿瘤转移抑制基因的药物。

7. 总结

目前看来，肿瘤转移抑制基因是一类为数不多的基因，它们的不表达情况或者功能缺失情况与肿瘤细胞的转移能力正相关。不过如果在动物模型中重新表达这些肿瘤转移抑制基因，则可以抑制肿瘤转移发生，但不能影响肿瘤细胞的生长。实验数据和流行病学数据都表明，在患者被确诊身患肿瘤时，已经有肿瘤细胞从原发灶处脱落，进入机体循环系统了。这些散播细胞中有一部分会在循环系统或者远隔器官中死亡，但还有一部分则能够存活下来，繁殖形成微小转移灶或者发生克隆性增殖，形成临床上可见的转移灶。因此，如何抑制微小转移灶向可见转移灶转变是一个关键问题，而肿瘤转移抑制基因正是针对这一过程发挥作用，因此，它们为我们提供了一条新的肿瘤治疗途径。

虽然从技术上来说，要针对一个起负向调控作用的基因进行操作比较困难，但最近报道的重组蛋白表达、直接施用重组蛋白，以及针对受肿瘤转移抑制基因调控的下游靶点的药物等成功案例也给我们带来了一点希望。随着功能基因组学以及蛋白质组学技术的进步，我们一定会更加容易地发现更多肿瘤转移抑制基因，可供我们选择的治疗靶点也会越来越多，“质量”越来越好，比如我们最近就发现了microRNA转移抑制子。

随着肿瘤转移抑制领域的研究不断深入，我们又发展出了一种新的治疗方法，但与此同时，问题也变得更加突出。比如普遍性问题，即某一肿瘤转移抑制基因与好几种不同肿瘤细胞的关系；特异性问题，即某一肿瘤转移抑制基因专门针对处于不同转移部位的肿瘤细胞的问题；还有肿瘤转移抑制基因对正常细胞的毒性问题等等这都需要我们予以系统的解答（背景知识2）。将来发现的肿瘤转移抑制基因有可能会更适合当做治疗的靶点，但也可能不太适合。无论如何，我们在本文中介绍的这些方法都可以推广，用于更多的肿瘤转移抑制基因，而更先进的信息处理技术也会帮助我们在使用以肿瘤转移抑制基因为基础的治疗过程中，简化药物筛选和患者选择的过程。

背景知识2：肿瘤转移抑制基因研究领域几大尚未解决的关键问题
普遍性问题大部分已发现的肿瘤转移抑制基因都只在病理学研究中予以过验证，我们还需要对这些基因表达缺失或突变的比例以及使用何种方法借助这些基因进行治疗的问题进行详细的研究。由于存在肿瘤细胞在早期就已经在体内广泛散播的事实，肿瘤转移抑制蛋白是不是能够抑制肿瘤细胞的浸润也是值得研究的课题。
特异性问题最近的研究结果表明肿瘤转移具有明显的组织偏好性，而且这背后隐藏着极为复杂的遗传调控机制。同时该现象也表明肿瘤转移抑制作用还具有高度的组织特异性。我们才刚刚开始对肿瘤转移抑制基因的肿瘤转移抑制作用进行检测。最近有两项这方面的研究报道发表。
适应性问题做为上述问题的延续，我们想知道，重建肿瘤转移抑制基因功能的疗法是不是只有在肿瘤细胞缺失了这种肿瘤转移抑制基因的功能时才能奏效。这种方法对于其它“无关的”肿瘤细胞会不会因为其它潜在的途径奏效呢？
毒性问题从理论上来说，重建某一起到负向调控作用的缺失基因，比如肿瘤转移抑制基因的功能时，其毒性要远小于重建起到正向调控正常细胞生理功能作用的基因功能。但是我们观察到有几个肿瘤转移抑制基因会直接对细胞必须的信号通路起到负向调控作用，那么这是不是一个值得研究的毒性问题呢？
整合问题要将肿瘤转移抑制基因疗法与现有抗癌疗法相整合也是需要研究的问题，比如抑制肿瘤转移之后会不会降低肿瘤细胞对传统化疗方法的敏感性呢？
患者选择问题我们现在已经发现了好几种药物，对于具有某些分子损伤的患者特别有效。但我们应该采用哪种分子标志物作为选择患者的依据呢？原发肿瘤是一个合适的选择吗？
实验设计问题有些患者进入临床试验之后通常都会发生治疗失败、肿瘤转移和复发的情况。那么这些患者是不是能够进入肿瘤转移抑制临床试验，并从中获益呢？

小词典
肿瘤转移细胞克隆性繁殖过程（Metastaticcolonization）指的是从原发灶脱离下来的肿瘤转移细胞在新的“定居点”处从小的转移灶逐渐生长形成临床可见的、大的转移灶的过程。
EB病毒（Epstein–Barr virus）属于疱疹病毒属，能导致人类患上传染性单核细胞增多症（infectiousmononucleosis）。EB病毒感染也与伯基特淋巴瘤（Burkitt’slymphoma）和鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma）有关。EB病毒也可能与其它肿瘤相关。
糖皮质激素反应途径（Glucocorticoid responsepathway）是一种核激素受体信号途径，它能直接调控参与机体代谢和免疫反应的基因。糖皮质激素受体在与其配体类固醇激素结合之后能诱导下游基因的转录表达。

节奏性化疗方案（Metronomicchemotherapy）即以相对较小的单次剂量和相对较多的给药次数的化疗方案，该方案完全不同于传统的最大耐受剂量给药方法。
TRAMP小鼠模型是一种转基因前列腺癌小鼠动物模型，我们可以在该模型上观察到前列腺癌的各个病理阶段。10~20周龄的TRAMP小鼠已经100%患上了前列腺癌。
纵隔淋巴结（Mediastinal lymphnode）即在两肺中间，胸腔正中部位的淋巴组织，上口位于胸廓入口处，底部位于隔膜之上。纵隔淋巴结是肺和其它肿瘤经常发生转移的部位。
正位异种移植（Orthotopic xenograf）即将人体肿瘤细胞注射到啮齿动物体内相同器官的方法。
异位异种移植（Heterotopicxenograft）即经常由于某些技术原因的限制，我们只能将人体肿瘤细胞注射到啮齿动物体内与该肿瘤细胞来源器官不同的器官的方法。
组蛋白去乙酰化酶（Histonedeacetylases）能够通过去除核小体组蛋白上赖氨酸位点的乙酰化作用来调控染色质的结构与功能，通常的作用都是抑制基因转录。
DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferases）能催化DNA链上的胞嘧啶甲基化，通常的作用都是抑制基因转录。
失巢凋亡现象（Anoikis）即细胞因为脱离了其生长所需要的基质而死亡的现象。
渗透泵（Osmoticpump）是一种小型可植入式的药物泵，依靠盐浓度来吸收组织间液从而产生压力，以规定的模式将药物释放出来。
合成致死现象（Syntheticlethal）是一种遗传现象，指的是如果发生两种非致死突变或分子损害结果导致细胞无法继续生存的现象。在药物研发领域，可以利用这种机制，比如在只有一种分子损害的情况下某种药物对细胞是无毒的，但是如果细胞同时发生了第二种分子损害，该药物对于细胞就具有毒性了。

原文检索：
Steven Christopher Smith and Dan Theodorescu. (2009) Learningtherapeutic lessons from metastasis suppressor proteins. NatureReviews CanCer, 9:253-264.

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