RT-PCR(reversetranscriptasepolymerasechainreaction)逆转录酶- t7 rna polymerase

RT-PCR原理

  RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术,可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断,并且可以用于定量监测某种RNA的含量。(检测基因表达的方法,参见NorthernBlot法。)

RT-PCR的关键步骤在是RNA的反转录,要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种,即鸟类成髓细胞性白细胞病毒(avianmyeloblastosis virus,AMV)反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒(moloney murine leukemiavrius,MMLV)反转录酶。RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-timePCR)。为了与逆转录PCR相区别,通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-timequantitative PCR)。

(逆转录:由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”,由依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)来完成。随后,DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成,随每个循环倍增,即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解,留下互补DNA。 )

real timeRT-PCR

实时PCR(real-timePCR),属于定量PCR(Q-PCR)的一种,以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。

 real time PCR 的定量使用萤光色素,目前有二种方法。一种是在dsDNA中插入特异的萤光色素;另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针(probe)。

 real time PCR 与 reverse transcription PCR相结合,能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RTPCR的组合又被称之为“定量RT-PCR(quantitative RT-PCR)”

RT-PCR技术相关试剂  

oligo:多聚体,相当于mRNA引物

  AMV(M-MLV):逆转录酶

  dNTP:脱氧核苷酸

  RNase:RNA酶抑制剂

  PCR Buffer:RT-PCR缓冲液

  MgCl2:2价镁离子

RT-PCR操作步骤与方法

一、总RNA提取

1. 取200mg组织,放到1.5mlEP管中,加入1mlTrizol剪碎。

2. 震荡30s。

3. 加0.2ml氯仿,剧烈摇动30s,室温3min。

4. 12000×g,4℃离心,15min。

5. 吸上层无色水相,移入另一EP管中(约0.5ml)。

6. 加等体积异丙醇,-20℃,30min。

7. 12000×g,4℃离心,10min。在管底部可见微量RNA沉淀

8. 弃上清,加75%乙醇1ml,振荡。

9. 7500×g,4℃离心,10min。

10. 弃上清,用滤纸小心吸取残留液体,室温干燥5-10min。

11. 沉淀溶于20μlDEPC水,取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD280

12. 计算浓度与纯度,-70℃保存。

二、逆转录合成cDNA第一链

反应体系如下
RT-PCR(reversetranscriptasepolymerasechainreaction)逆转录酶- t7 rna polymerase

混匀快速离心一次

反应条件如下


-20℃ 冰箱冻存

三、PCR反应



混匀快速离心一次

反应条件如下

PCR产物-20℃冰箱保存

取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl2%琼脂糖凝胶电泳120V。

100mA30min 溴化乙锭染色,凝胶成象仪成象并保存结果。

  

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