爱华网RT-PCR原理
RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。（检测基因表达的方法，参见NorthernBlot法。）
RT-PCR的关键步骤在是RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avianmyeloblastosis virus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemiavrius,MMLV）反转录酶。RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-timePCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-timequantitative PCR)。（逆转录：由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。 ）
real timeRT-PCR
实时PCR(real-timePCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。
real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。一种是在dsDNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。
real time PCR 与 reverse transcription PCR相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RTPCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”
RT-PCR技术相关试剂
oligo:多聚体，相当于mRNA引物
AMV（M-MLV）：逆转录酶
dNTP：脱氧核苷酸
RNase：RNA酶抑制剂
PCR Buffer：RT-PCR缓冲液
MgCl2：2价镁离子
RT-PCR操作步骤与方法
一、总RNA提取
1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。
2. 震荡30s。
3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。
4. 12000×g，4℃离心，15min。
5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。
6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。
7. 12000×g，4℃离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀
8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。
9. 7500×g，4℃离心，10min。
10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。
11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD280
12. 计算浓度与纯度，-70℃保存。
二、逆转录合成cDNA第一链
反应体系如下
混匀快速离心一次
反应条件如下
-20℃ 冰箱冻存
三、PCR反应
混匀快速离心一次
反应条件如下
PCR产物-20℃冰箱保存
取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl2%琼脂糖凝胶电泳120V。
100mA30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。
